新版绿色荧光蛋白

绿色荧光蛋白分子生物学

及其应用新版绿色荧光蛋白第1页TheNobelPrizeinChemistry"forthediscoveryanddevelopmentofthegreenfluorescentprotein,GFP"OsamuShimomura

MartinChalfie

RogerY.Tsien

MarineBiologicalLaboratory,

WoodsHole,MA,USA;BostonUniversityMedicalSchoolMassachusetts,MA,USAColumbiaUniversity

NewYork,NY,USA

UniversityofCalifornia

SanDiego,CA,USA;HowardHughesMedicalInstitute

新版绿色荧光蛋白第2页年诺贝尔化学奖取得者及其贡献下村修，日本人，名古屋大学理学博士毕业后赴美，先后在美国普林斯顿大学、波士顿大学和伍兹霍尔海洋生物试验所工作。1962年从一个水母中发觉了荧光蛋白，被誉为生物发光研究第一人。钱永健，美籍华裔，现为美国加州大学圣迭戈分校生物化学及化学系教授、美国国家科学院院士、国家医学院院士，年沃尔夫医学奖得主。其主要贡献在于利用水母发出绿光化学物来追查试验室内进行生物反应，他被认为是这方面公认先驱。马丁·沙尔菲，美国哥伦比亚大学生物学教授，他获奖主要贡献在于向人们展示了绿色荧光蛋白作为发光遗传标签作用，这一技术被广泛利用于生理学和医学等领域。新版绿色荧光蛋白第3页1962年Shimomure等首先从维多利亚水母(AequoreaVictoria)中分离出了GFP(Green-FluorescentProtein)。

绿色荧光蛋白研究史

维多利亚水母

(AequoreaVictoria)新版绿色荧光蛋白第4页Atesttubecontainingasampleofacyan(greenish-blue)fluorescentproteinfromaseaanemoneilluminatedbyultra-violetlightfrombelow.新版绿色荧光蛋白第5页水母体内有一个发光蛋白——Aequorin，它与钙离子结合时会发出蓝光，这道蓝光立刻被一个蛋白吸收，从而发出绿色萤光。这种捕捉蓝光、发出绿光蛋白质，就是GFP新版绿色荧光蛋白第6页水母发光蛋白发出蓝光经过能量转移激发GFP发出绿光水母发光蛋白脱辅水母发光蛋白+氧化荧光素+蓝光绿色荧光蛋白绿光水母素在钙离子刺激下发光，其能量可转移到GFP上，刺激GFP发光。这是物理化学中已知荧光共振能量转移（FRET）在生物中发觉。钙离子蓝光发光过程新版绿色荧光蛋白第7页下村修下村修所以成为首位从水母中分离出GFP，并发觉这种蛋白质在紫外光下呈亮绿色科学家，他被誉为生物发光研究第一人新版绿色荧光蛋白第8页1992年Prasher等克隆了GFP基因cDNA，并分析了GFP一级结构。

绿色荧光蛋白研究史新版绿色荧光蛋白第9页马丁·沙尔菲假如说下村修是绿色荧光蛋白“接生婆”，沙尔菲则是绿色荧光蛋白价值发觉者。马丁·沙尔菲等对实现GFP基因表示做出了突出贡献他获奖主要贡献在于向人们展示了绿色荧光蛋白作为发光遗传标签作用。新版绿色荧光蛋白第10页

绿色荧光蛋白研究史1994年Chalfie等首次在大肠杆菌细胞和线虫中表示了GFP，开创了GFP应用研究先河。新版绿色荧光蛋白第11页钱永健钱永健在改造GFP方面取得了卓越成就。1995年，他完成单点突变（S65T）显著提升了GFP光谱性质，起荧光强度和光稳定性也大大增强。钱永健主要贡献在于利用GFP来追踪追踪各种生物细胞进行生物反应，他是这方面公认先驱。新版绿色荧光蛋白第12页之后很快发觉GFP能在各种异源细胞中表示，GFP在细胞学、分子生物学和医学、病毒学等领域中快速掀起了一股热潮。1997年10月18-22日在美国New-Jersey专门召开了一次关于GFP国际会议。

绿色荧光蛋白研究史新版绿色荧光蛋白第13页年1月7日，东北农业大学刘忠华教授主持转基因克隆猪课题取得成功。中国首例绿色荧光蛋白转基因克隆猪成功产下2头含有绿色荧光遗传特征小猪。这是继美国、韩国、日本之后第四例成功经过体细胞核移植方式生出绿色荧光蛋白转基因克隆猪。

绿色荧光蛋白研究史新版绿色荧光蛋白第14页绿色荧光蛋白结构解析新版绿色荧光蛋白第15页绿色荧光蛋白结构解析维多利亚水母GFPcDNA编码区全长717nt新版绿色荧光蛋白第16页绿色荧光蛋白结构解析维多利亚水母GFP由238aa组成，分子量约27kD新版绿色荧光蛋白第17页绿色荧光蛋白结构解析GFP晶体结构显示,蛋白质中央是一个罐形结构,长420nm,宽240nm,由11个围绕中心α螺旋反平行β折叠组成,荧光基团形成就是从这个螺旋开始,罐顶部由3个短垂直片段覆盖,底部由一个短垂直片段覆盖,对荧光活性很主要生色团则位于大空腔内。新版绿色荧光蛋白第18页绿色荧光蛋白结构解析AtopologydiagramofthefoldingpatterninGFP.The-sheetstrandsareshowninlightgreen,a-helicesinblue,andconnectingloopsinyellow.Thepositionsinthesequencethatbeginandendeachmajorsecondarystructureelementarealsogiven.Theanti-parallelstrands(exceptfortheinteractionsbetweenstrands1and6)makeatightlyformedbarrel.新版绿色荧光蛋白第19页ThegreenfluorescentproteinGFPconsistsof238aminoacids,linkedtogetherinalongchain.Thischainfoldsupintotheshapeofabeercan.Insidethebeercanstructuretheaminoacids65,66and67formthechemicalgroupthatabsorbsUVandbluelight,andfluorescesgreen.

绿色荧光蛋白罐形结构绿色荧光蛋白结构解析新版绿色荧光蛋白第20页Thedimercontactregion.Thetwopolypeptidechainsassociateoverabroadarea,withasmallhydrophobicpatch(intheyellowbox)andnumeroushydrophiliccontacts.Thetwo-foldsymmetryaxisisintheplaneofthepage,andismarkedbytheredarrow.Thepolarresiduesaremarkedwithredatomsforoxygenandbluefornitrogen.绿色荧光蛋白结构解析新版绿色荧光蛋白第21页绿色荧光蛋白发光特征GFP吸收光谱,最大峰值为395nm(紫外),并有一个峰值为470nm副峰(蓝光);发射光谱最大峰值为509nm(绿光),并带有峰值为540nm侧峰(Shouder)。新版绿色荧光蛋白第22页绿色荧光蛋白发光特征GFP光谱特征与荧光素异硫氰酸盐(FITC)很相同，所以为荧光素FITC设计荧光显微镜滤光片组合也适用GFP观察。尽管450～490nm(蓝光)是GFP副吸收峰，但因为长波能量低，细胞忍受能力强,所以更适合于活体检测。GFP荧光极其稳定，在激发光照射下，GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素(fluorescein)强，尤其在450～490nm蓝光波长下更稳定。新版绿色荧光蛋白第23页GFP需要在氧化状态下产生荧光，强还原剂能使GFP转变为非荧光形式，但一旦重新暴露在空气或氧气中，GFP荧光便马上得到恢复。而一些弱还原剂并不影响GFP荧光。中度氧化剂对GFP荧光影响也不大，如生物材料固定、脱水剂戊二酸或甲醛等。但GFP对一些封片指甲油尤其敏感。GFP荧光在pH7.0-12.0稳定，在pH5.5-7.0开始受到影响，高温(>70℃)、极端pH或胍基氯化物条件下，GFP会变性，荧光消失，一旦外界条件恢复正常，荧光将部分恢复。绿色荧光蛋白发光特征新版绿色荧光蛋白第24页GFP发色团骨架在左边。蛋白质链形成一个圆柱形罐头（蓝色），子链一部分直接从中间穿过（绿色），发色团刚好在罐头盒中间，它被保护起来以免受周围环境影响。这种保护对于发射荧光是必需。一但发色团吸收一个光子，激活水分子通常就会夺取它能量。不过在蛋白质内部改为发射能量稍低光子来释放能量，使它得到了保护。发色团（右图）由蛋白质链上三个氨基酸：甘氨酸，酪氨酸和苏氨酸（或丝氨酸）自发形成。新版绿色荧光蛋白第25页绿色荧光蛋白发光基团GFP荧光产生主要归功于分子内第65、66、67位丝氨酸、酪氨酸、甘氨酸形成生色团功效。新版绿色荧光蛋白第26页GFP荧光生色团

翻译出蛋白质折叠环化之后,在O2存在下，分子内Gly67酰胺对第Ser65羧基亲核攻击形成第5位碳原子咪唑基,Tyr66α2β键脱氢反应之后，造成芳香团与咪唑基结合。这么,GFP分子中形成对羟基苯甲酸咪唑环酮生色团,该过程能够自动催化完成。绿色荧光蛋白发光基团新版绿色荧光蛋白第27页Stereoviewofthefluorophoreanditsenvironment.His148,Gln94andArg96canbeseenonoppositeendsofthefluorophoreandprobablystabilizeresonantformsofthefluorophore.Charged,polar,andnon-polarsidechainsallcontactthefluorophoreinsomeway.绿色荧光蛋白发光基团His48Gln94Arg96新版绿色荧光蛋白第28页ModelofthefluorophoreanditsenvironmentsuperposedontheMAD-phasedelectrondensitymapat2.2Åresolution.Thecleardefinitionthroughoutthemapallowedthechaintobetracedandsidechainstobewellplaced.ThedensityforSer65,Tyr66andGly67isquiteconsistentwiththedehydrotyrosine-imidazolidonestructureproposedforthefluorophore.Manyofthesidechainsadjacenttothefluorophorearelabeled.绿色荧光蛋白发光基团新版绿色荧光蛋白第29页

当前对GFP荧光发光机制还不清楚，Morise等人曾提出一个能量传递模式图来解释水母发光机制，但并未取得认同。Chattoaj等对GFP进行了光谱分析，结合前人工作提出，GFP有两个显著吸收带，对应于GFP两种不一样构象基态A和B。基态A对应于395nm吸收峰，基态B对应于475nm吸收峰，基态A占优势，基态B分子数量约是基态A1/6，两种基态间能迟缓地转换，但激发态(*)之间转换很快且发生了质子转移，A*快速高效地衰变至另一激发态，应该存在一个中间过分态I，质子转移使A*转变成I*,I*回迁到基态I时产生发射峰504nm荧光，构象改变使I*转变成B*，由B*到B发射荧光而不发生质子转移。当前，对于GFP作用机理较为认同仅仅是：GFP是生物发光过程中能量受体，而且是最终发光体，不一样生物发光机制各不相同，不一样突变体发光机制也有很大差异。绿色荧光蛋白发光机制新版绿色荧光蛋白第30页475nm504nm绿色荧光蛋白发光机制新版绿色荧光蛋白第31页在离体状态下GFP对高温(70OC)、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通酶(链霉蛋白酶除外)有较强抗性GFP融合蛋白荧光灵敏度远比荧光素标识荧光抗体高，抗光漂白能力强，所以更适合用于定量测定与分析。但因为GFP不是酶，荧光信号没有酶学放大效果，所以GFP灵敏度可能低于一些酶类汇报蛋白。因为GFP荧光是生物细胞自主功效，荧光产生不需要任何外源反应底物，所以GFP作为一个广泛应用活体汇报蛋白,其作用是任何其它酶类汇报蛋白无法比拟。GFP其它生化特征新版绿色荧光蛋白第32页GFP作为标识蛋白优点①荧光稳定②检测方便③无种属特异性，也无有细胞种类和位置限制④GFP对受体细胞基本无毒害⑤易于构建载体，不受假阳性干扰⑥不需任何反应底物和辅助因子⑦可制成永久标本⑧灵敏度高新版绿色荧光蛋白第33页GFP基因改进更换GFP生色团氨基酸改变碱基组成除去GFP基因中隐蔽剪接位点插人植物内含子更换强开启子等突变体GFP对密码子进行优化修饰增加荧光强度和热稳定性，促进了生色团折叠新版绿色荧光蛋白第34页新版绿色荧光蛋白第35页

Zolotukhin等（1996）改变了wtGFP基因编码区中88个密码子中92个碱基而用人类基因组中惯用密码子代替，将GFP荧光强度提升22倍，适合在哺乳动物细胞中高效表示。人工GFP新版绿色荧光蛋白第36页GuohongZhang等（1996）将GFP荧光强度提升了35倍，转染16h~24h后仍可稳定地测定荧光。增强型GFP新版绿色荧光蛋白第37页

将wtGFP中Ser65用Thr替换，得到突变体。S65T-GFP，激发谱中只有一个峰，且红移至490nm，用蓝光即可激发RSFP，使之更适于普通荧光显微镜观察。红移荧光蛋白新版绿色荧光蛋白第38页

双突变体Y66H/Y145F能在381nm光激发下产生445nm蓝光，故称BFP。这种蓝光能深入激发GFP产生绿光，即发生荧光共振能量转移现象（FRET）

。蓝色荧光蛋白新版绿色荧光蛋白第39页EBFP：增强蓝色荧光蛋白；ECFP：增强蓝绿色荧光蛋白EGFP：增强绿色荧光蛋白；EYFP：增强黄色荧光蛋白绿色荧光蛋白变异体发色基团结构新版绿色荧光蛋白第40页基于GFP传感器新版绿色荧光蛋白第41页

一个被修饰过用来感应锌离子浓度蓝色荧光蛋白：当红色锌离子连接到蓝色被修饰过发色团上后，蛋白质会发出亮度增强一倍荧光从而形成轻易被检测到可见信号。新版绿色荧光蛋白第42页CrystalstructureofaCu-boundgreenfluorescentproteinZnbiosensorCrystalstructureofaZn-boundgreenfluorescentproteinbiosensor锌离子GFP传感器新版绿色荧光蛋白第43页88mMFIP-CBSMand88mMCaM(panelsA–C)88mMFIP-CBSMalone(panelsD–F).钙离子GFP传感器新版绿色荧光蛋白第44页pHtitrationsofGFPs.(A)FluorescenceandabsorbanceofGFP-S65TasafunctionofpH.DatawerefittedtoEq.1withpKaandnHparametersgiveninthetext.Forcomparison,fluorescencetitrationforfluoresceinisshown(---).(B)FluorescenceofGFP-F64L/S65T,GFP-Y66H,andGFP-T203IasafunctionofpHwithcurvefitsasinA.pH-GFP传感器新版绿色荧光蛋白第45页新版绿色荧光蛋白第46页GFP在生物研究中应用

新版绿色荧光蛋白第47页GFP在动物学研究中应用GFP作为新型汇报基因用于转基因研究

作为汇报基因构建基因工程载体。以GFPS65T基因作为筛选标识新型克隆载体，以绿白斑筛选法筛选阳性重组子，替换Lacz蓝白斑筛选，不需X一gal。GFP融合蛋白用于研究蛋白质定位、移动及相互作用

HaleC.A.等利用GFP标识，研究了可溶性微管蛋白FtsZ与其内膜受体ZipA间相互作用，发觉，ZipA-GFP融合蛋白在细胞壁溢缩前和溢缩过程中均位于FtsZ与膜相关特殊环中。新版绿色荧光蛋白第48页GFP作为一个新型免疫标识物

利用GFP发光特征使免疫反应呈绿色荧光从而能够直接观察，可望取代传统标识技术，建立特异、灵敏、简便和快速免疫诊疗新方法。岳莉莉等成功地实现了gfp与HBVe抗原基因融合后在大肠杆菌和昆虫细胞中高效表示，得到既能发射荧光又含有抗原性双功效融合蛋白，为取得一个新型发光免疫诊疗试剂奠定了基础。GFP在动物学研究中应用新版绿色荧光蛋白第49页GFP在植物研究中应用作为汇报基因用于转基因植物研究

GFP作为新型汇报基因用于植物遗传转化，能够替换与筛选相关抗生素或抗除草剂标识基因，既优化植物遗传转化过程，又使转基因植物更安全。用于植物基因表示调控研究

基因表示可进行活体检测，利用GFP基因能够很方便地研究基因表示时空性。Aspuria等()将GFP与受生长素诱导开启子重组后导入植物，用生长素诱导后，经过观察侧根分生组织中是否有GFP积累来证实生长素时空表示。新版绿色荧光蛋白第50页Thephotographwastaken6dayspost-inoculationusingaDRHandLamp.Thegreenfluorescentspots(againstabackgroundofredchlorophyllfluorescence)showtheexpandingfociofvirus-infectedcells.病毒介导EGFP在烟草中表示新版绿色荧光蛋白第51页RNAsilencingofgreenfluorescentprotein(GFP)(center)inleavesfromNicotianabenthamianaissuppressedbyananimal(left;B2proteinofflockhousevirus)oraplant(right)viralsuppressor,leadingtoenhancedGFPexpression(lightergreen/yellowareas).GFP用于植物RNA缄默研究新版绿色荧光蛋白第52页用于植物信号转导研究

GFP结合荧光共振能量转移(FREP)为研究植物信号转导也提供了新方法。比如：Allen等用YEP-GFP-Ca2+

传感器检测拟南芥保卫细胞内Ca2+

浓度改变，结果表明，外源Ca2+

和ABA都能引发保卫细胞内Ca2+浓度改变。这和过去用荧光染色法观察到结果一致。GFP在植物研究中应用新版绿色荧光蛋白第53页GFP在微生物研究中应用GFP用于微生物与宿主相互作用研究利用GFP标识基因能够研究病毒、细菌和真菌等侵染植物过程和机制。Bowyer等在小麦病原菌中构建了含异柠檬酸酶开启子GFP基因，监测到T.yallundae侵染小麦时碳代谢过程。GFP用于检测环境微生物迁移

Leff等将GFP克隆到基因工程菌中,监测其在水环境中存活和去向。Scott等以GFP红移突变体作为标识基因,有效地追踪了乳酸细菌在复杂厌氧系统中运移。新版绿色荧光蛋白第54页GFP在微生物研究中应用GFP微生物传感器

将汇报基因转入污染物代谢基因开启子中可设计出生物传感器,当特定污染物存在时即开启。Ikeno等分别以GFP和Ps作为汇报基因和开启子，转入E.coli重组子中，用以检测水体中微量苯衍生物。Roberto等以GFP作为汇报基因，设计出可检测环境中亚微克级含量砷和砷酸盐生物传感器。新版绿色荧光蛋白第55页Moller等研究发觉GFP标识P.putidaRI细菌主要聚集在生物膜表层，而Acinetobactersp.C6则附着在生物膜底层生长。硕士物膜生长特征及其菌落特征C6:redR1:blue新版绿色荧光蛋白第56页GFP在微生物研究中应用GFP在真菌研究中应用

（1）GFP基因经过随机插入真菌基因组方法,已经被成功地用来研究真菌生态、生防菌对病原菌侵染模式及病原菌与其寄主关系等（2）GFP基因经过与目标基因融合方法,则被广泛地用于真菌基因转录规则、蛋白质及细胞器定位、细胞亚结构和蛋白质功效等研究.新版绿色荧光蛋白第57页GFP在生物医学中应用药品筛选利用GFP荧光探针，从数量众多化合物中判断出那些化合物含有与信号分子相同，能引发配体-受体复合物迁移并介导生理反应功效。如介导糖皮质激素受体（hGR)迁移药品筛选模型成功构建。用于临床检验示踪病原菌

新版绿色荧光蛋白第58页GFP在肿瘤研究中应用

GFP在肿瘤研究中应用新版绿色荧光蛋白第59页GFP在蛋白质细胞定位中应用新版绿色荧光蛋白第60页新版绿色荧光蛋白第61页Animageofasinglemamaliancellwithgreen-to-redfluorescentDendramarkingfibrillarin,aproteinconcentratedinnucleoli,whicharesmall,roundbodiesinthecell'snucleus,composedofproteinandRNA.新版绿色荧光蛋白第62页科学使用绿色荧光蛋白跟踪大脑细胞活动新版绿色荧光蛋白第63页

伴随病毒在宿主体内不停扩散，经过跟踪发出绿光就可观察病毒扩散路径；或者把它接合到一个蛋白质上并经过显微镜观察它在细胞内部移动。新版绿色荧光蛋白第64页a.线粒体；b.肌动蛋白；c.微管蛋白d.高尔基体；e.纽蛋白；f.组蛋白新版绿色荧光蛋白第65页LocalisationoftheERtargetedformofGFP

新版绿色荧光蛋白第66页RootsfromArabidopsisplantstransformedwithaconstructcontaining

thecyclinB1;1promoter,cyclinB1;1genefusedtoGFP.

Cellsfluorescingingreenareinmitosis新版绿色荧光蛋白第67页GFP转基因生物新版绿色荧光蛋白第68页发绿光老鼠1997年7月日本大阪大学科研人员首次培育出能够夜里发光含有绿色荧光蛋白老鼠。新版绿色荧光蛋白第69页1998年，EduardoKac经过转基因技术培育出第一条能够发出绿色荧光狗。发绿光狗新版绿色荧光蛋白第70页转GFP基因蜜蜂新版绿色荧光蛋白第71页转GFP基因蝾螈（斑马鱼）

新版绿色荧光蛋白第72页

转GFP基因兔子新版绿色荧光蛋白第73页GFP基因在蛾子眼部表示新版绿色荧光蛋白第74页

年7月12日韩国科学家成功培育出身体可发出荧光转基因鸡。发荧光鸡新版绿色荧光蛋白第75页发红光猫

韩国科学家采取基因工程技术克隆“荧光猫”年登上世