淋巴瘤基因克隆性重排检测专家讲座

血液肿瘤形态学（Morphology）聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)毛细管凝胶电泳(CE)荧光实时定量PCR(RTQT-PCR)一代测序(Sanger)二代测序(NGS)分子生物学（Molecular）免疫组化（IHC）流式细胞术（FCM）免疫学（Immunology）荧光原位杂交（FISH）细胞遗传学（Cytogenetics）辅助诊疗预后分析指导用药MRD检测血液肿瘤（常规肿瘤）检测方案-MICM综合分子检测(旌准方案)淋巴瘤基因克隆性重排检测专家讲座第1页分子检测检测基因方法IG/TCR基因重排IGH，IGK，IGL，TRB，TRD，TRGGEL(PAGE)ABI(CE)NGSIGHV超突变IGHGEL(PAGE)ABI(CE)NGS基因突变EZH2,DNMT3A,IDH2…SangerNGSMoffitt,A.B.andS.S.Dave().JClinOncol35(9):955-962.分子检测-淋巴瘤淋巴瘤基因克隆性重排检测专家讲座第2页最丰富阳性对照5BIOMED-2唯一授权商品化试剂1全方面涵盖各种T\B细胞重排类型可疑淋巴组织增生性疾病克隆性分析“金标准”超出400例临床样本验证，反应体系稳定，结果可靠324淋巴细胞克隆性基因重排检测产品特点淋巴瘤基因克隆性重排检测专家讲座第3页B-CellReceptors(BCR)/Immunoglobulins(Ig)T-CellReceptor(TCR)蛋白基因染色体定位Ig重链IGH14q32Ig轻链IGK2p12Ig轻链IGL22q11蛋白基因染色体定位TCRαTRA14q11TCRβTRB7q32TCRγTRG7p15TCRδTRD14q11.2淋巴细胞克隆性基因重排检测目标分子Ig和TCR--单一基因重排，即恶性淋巴细胞淋巴瘤基因克隆性重排检测专家讲座第4页IGH,TRB&TRD:V,D,andJIGK,IGL,andTRG:VandJregions正常淋巴细胞成熟过程/良性病变多克隆性各种形式基因重排恶性淋巴瘤发生过程单克隆性突出单一形式基因重排多样性与克隆性淋巴瘤基因克隆性重排检测专家讲座第5页判别诊疗：明确是淋巴组织反应性还是淋巴细胞恶性增殖辅助诊疗：少见类型淋巴瘤，如肝脾T细胞淋巴瘤亚类分析：明确是B淋巴恶性增殖还是T细胞恶性增殖区分同一患者两种淋巴细胞恶性肿瘤，包含复发与继发淋巴瘤微小残留病灶监测，评定治疗效果或复发风险（NGS方法）细胞免疫治疗监测，监测回输T细胞增殖情况和淋巴组织起源肿瘤细胞去除效果（NGS）5%～15%病例表现复杂，即使做了大量免疫标志也可能难以判别其良恶性，需要深入伎俩区分。利用分子生物学伎俩分析Ig和TCR基因克隆性重排被WHO公认为该疾病诊疗伎俩主要补充。淋巴细胞克隆性基因重排检测临床意义淋巴瘤基因克隆性重排检测专家讲座第6页基于PCR检测技术，简便、快速、成本较低，所需DNA量少，对DNA质量要求不高。灵敏度高于10%，需配制胶，安全清洁性较差。基于PCR-毛细管电泳检测技术，敏感性高，检测周期较长，结果愈加直观可靠当前市场最被接收检测方法。灵敏度无法满足MRD要求，难以定量和得到序列。新兴技术，更高灵敏度（10-6），更高分辨率，更高通量，更广泛应用。但成本高，仪器贵，操作复杂，时间长。（IGH,IGK,）（IGL）（TRB,TRD,）（

TRG）BIOMED-2方案，唯一授权）IGHV（依据ERIC指南）IGH,IGK,TRB,

TRGIGHV基于不一样方法产品系列-Invivoscribe企业淋巴瘤基因克隆性重排检测专家讲座第7页Invivoscribe企业IdentiCloneTM系列产品是基于PCR克隆性检测产品，是BIOMED-2唯一授权商品化试剂，取得CE认证，以其高度灵敏性和特异性，成为可疑淋巴组织增生性疾病克隆性分析“金标准”。IdentiCloneTM系列产品含有精心优化标准化试剂组成，含有最丰富阳性对照，涵盖各种T\B细胞重排类型，经过了超出400例临床样本验证，按照临床产品标准进行质检和质控，反应体系稳定，结果可靠。从Biomed-2到Invivoscribe-唯一授权淋巴瘤基因克隆性重排检测专家讲座第8页Biomed-2研究项目淋巴瘤基因克隆性重排检测专家讲座第9页Biomed-2研究项目（IGH为例）vanDongen,J.J.M.,etal.().Leukemia17:2257.淋巴瘤基因克隆性重排检测专家讲座第10页Biomed-2研究项目（IGH为例）vanDongen,J.J.M.,etal.().Leukemia17:2257.淋巴瘤基因克隆性重排检测专家讲座第11页结果分析（单）克隆性：扩增产物电泳在预期大小范围内一或双条带（峰）送检组织中，淋巴细胞抗原受体基因重排方式为单一性。表明组织中存在单克隆性增生细胞群。多克隆性：扩增产物电泳呈弥散涂抹状(smear)或阶梯状(高斯分布）送检组织中，淋巴细胞抗原受体基因重排方式为多样性。表明组织中不存在单克隆性增生细胞群。

无扩增产物：PCR扩增后电泳未见产物送检组织中细胞，抗原受体基因无重排（NK，非淋巴细胞）或DNA质量过差。Productsareheterodulex-treatedfollowedbyPAGEon6%gel250bp-300bp-400bp-IGHB(250-295bp)200bp-500bp-175bp-150bp-markerPMH2OS1S1S2S2淋巴瘤基因克隆性重排检测专家讲座第12页淋巴瘤应用基因重排检测进行辅助/判别诊疗方案淋巴瘤基因克隆性重排检测专家讲座第13页检测到克隆性重排未必一定发生恶性病变一些良性增生也可呈克隆性重排，如CD8+T细胞淋巴增生性病变、良性单克隆性丙种球蛋白病、皮肤淋巴瘤样丘疹病、免疫缺点患者严重EB病毒感染等；检测不到克隆性重排也不能排除恶性病变一些明确恶性病变免疫缺点患者中偶然检测不到克隆性重排，NK/T细胞淋巴瘤中IG和TCR基因呈胚系结构，即也无克隆性重排。IG或TCR基因重排不一定是谱系标志尤其是大多数前驱淋巴细胞性肿瘤中存在谱系交叉，如血管免疫母细胞学淋巴瘤（AITL）。单一发生可反应谱系，同时阳性只表示克隆性增生，不能判断谱系起源。假阳性和假阴性技术，引物，反应条件分子克隆性结果分析，应结合临床、形态学和免疫表型特征，方可做出淋巴瘤最终诊疗和分类。注意事项淋巴瘤基因克隆性重排检测专家讲座第14页对以下疾病提供主要预后信息:

慢性淋巴细胞白血病(CLL)前提：IGH克隆性重排为单克隆例外：

V3-21重排区表示与预后不良相关，与IGHV突变状态无关。SHM判断标准：IGHV突变百分比<2%≥2%SHM状态为突变突变PFS1-5年9.2-18.9年OS3.2-17.9-25.8年预后不良良好IGHV区SHM状态检测被推荐为新诊疗CLL患者预后分析生物标志物。PFS：无进展生存期（Progressionfreesurvival）OS：总生存期（Overallsurvival）中国CLL/SLL诊疗与治疗指南（版）IGHV区体细胞超突变检测临床意义淋巴瘤基因克隆性重排检测专家讲座第15页基于PCR检测技术，简便、快速、成本较低，所需DNA量少，对DNA质量要求不高。灵敏度高于10%，需配制胶，安全清洁性较差。基于PCR-毛细管电泳检测技术，敏感性高，检测周期较长，结果愈加直观可靠当前市场最被接收检测方法。灵敏度无法满足MRD要求，难以定量和得到序列。新兴技术，更高灵敏度（10-6），更高分辨率，更高通量，更广泛应用。但成本高，仪器贵，操作复杂，时间长。IGH,IGK,IGL,TRB,TRD,TRG（BIOMED-2方案，唯一授权）IGHV（依据ERIC指南）IGH,IGK,TRB,

TRGIGHV基于不一样方法产品系列-Invivoscribe淋巴瘤基因克隆性重排检测专家讲座第16页结合Leader和FR1区域引物在5’端连接有通用测序片段，这种设计，配合JH反向测序引物，能够实现PCR扩增产物双向测序。当前，欧洲慢性淋巴细胞性白血病研究机构（EuropeanResearchInitiativeonCLL，ERIC）指南即使用双向测序判断IGHV区体细胞超突变（SomaticHypermutation，SHM）状态。IGHVSHM检测淋巴瘤基因克隆性重排检测专家讲座第17页WM/LPLHCLMCLFLBLTLGLNKTCLTPLLDLBCLAITLALCLcHLLyP基于NGS技术一次性分析51基因判别诊疗DLBCL基因分型CLL/CLLFLTLGLMCLALCLPTLDDLBCLSMZLWM/LPL预后分层DLBCLFLMCLCLL/SLLWMBLHCLAITLNKTCLALCL靶向治疗按细胞起源基因分型：GCB型和ABC型《新英格兰医学杂志》最新基因分型：MCD型、N1型、BN2型、EZB型淋巴瘤51基因突变NGS检测淋巴瘤基因克隆性重排检测专家讲座第18页淋巴瘤51基因突变NGS检测淋巴瘤基因克隆性重排检测专家讲座第19页

针对临床应用设计

全方面覆盖WHO、NCCN、中国指南和教授共识中包括相关基因遵照临床常规诊疗流程，同其它诊疗技术协同使用