药物毒理学讲座

药品毒理学讲座药物毒理学讲座第1页

药品毒理学试验设计与原理

讲座

郑州大学公共卫生学院

职业卫生与职业医学教研室

李时恩

公卫院

室

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药物毒理学讲座第2页内容提要

●概述

●药品临床前毒性试验

●药效试验研究基本要求

●药效学试验举例

药物毒理学讲座第3页一、概述

(一)试验设计

(designofexperiment,DOE)

良好设计是顺利进行科学研究和数据统计分析先决条件，也是取得预期结果主要确保。药物毒理学讲座第4页设计包含专业设计和统计设计两部分：

专业设计是从各专业角度考虑试验科学安排，是基础。包含选题，建立假说，确定研究对象和技术方法等；

统计设计则是从统计学角度，考虑设计科学性和逻辑性，使研究结果含有重现性，更可靠，更科学，经得起时间考验。药物毒理学讲座第5页(二)医学科学研究种类

●临床研究

●流行病学研究

●动物试验研究药物毒理学讲座第6页(三)研究深度广度层次●

整体→系统→器官→组织

→细胞→亚细胞→分子水平●

个体群体●

体外

体内●

宏观微观药物毒理学讲座第7页(四)医学科学研究基础学科和方法学

●卫生统计学

●流行病学

●卫生毒理学药物毒理学讲座第8页

(五)毒理学及其相关术语

1.

毒理学(toxicology)

是研究化学物质对机体生物学作用及其机理学科；

研究化学物质对机体有益作用，即经过影响机体器官生理功效或细胞代谢活动到达防治疾病目标，属药品学范围；

研究化学物质对机体有害作

用及其防护办法，属预防医学范围。药物毒理学讲座第9页

2.外源化学物(xenobiotics)：

以前叫外来化合物，指存在于人类生活外界环境中、可能与机体接触并进入机体化学物质；它们并非人体组成成份，也非人体所需营养物质，也不是维持正常生理功效和生命所必需物质，但可由外界环境经一定步骤和路径与机体接触并进入机体，在体内展现一定生物学作用。确切地说，应称为“外来生物活性物质”。须强调：包含“药品”。药物毒理学讲座第10页外源化学物包含：

医药

农药

工业化学物

环境污染物

食品添加剂

产业性化学物：如化装品、洗涤剂等

与外源化学物相对应概念是内源活性化合物：指机体代谢过程中所形成产物或中间产物。药物毒理学讲座第11页3.

毒物(poison)

指在一定条件下，以较小剂量进入机体就能干扰正常生化过程或生理功效，引发暂时或永久性病理改变，甚至危及生命化学物质。

“毒物”与“非毒物”概念是相正确。药物毒理学讲座第12页

4.毒性(toxicity)化学物能够对机体造成损害能力，称为毒性。

在同等剂量下，化学物质对机体损害能力越大，其毒性越高。相对于同一损害指标，需要剂量越小化学物质，其毒性越大。药物毒理学讲座第13页如同“毒物”和“非毒物”是相正确一样，化学物质毒性高低含有相对意义。

对于毒性，一定要强调“量”概念。任何化学物质，只要到达一定剂量，对机体都含有毒性，而低于某一剂量水平时，则不含有毒性。

如人体必需微量元素Se、食盐等；

毒性大非人体必需化学物，在某一剂量范围内对机体不展现损害作用，有反而对某种疾病有治疗作用，如As、Pb。

所以，剂量(dose)是化学物质毒性决定原因。药物毒理学讲座第14页化学物质毒性除主要取决于剂量外，还与化学物对机体作用条件(如接触路径、接触方式：包含接触次数、时间、间隔等)、理化特征(如溶解度、分散度、挥发度、比重、硬度)、环境原因(如气温、气湿)、宿主原因(如物种、品系、性别、年纪、遗传素质、免疫水平、健康情况、营养情况)等相关。

所以，探讨化学物对机体生物学作用，关键是作用剂量和作用条件。即在严格控制条件下经过试验研究(动物试验)观察药品对机体及其组成部分作用规律及其原理。药物毒理学讲座第15页★

5.半数致死剂量

(medianletheldose,LD50)，或半数致死浓度(LC50)：指化学毒物能够引发受试对象死亡二分之一所需要剂量或浓度。又称致死中量。为一统计量。

毒物毒性大小，通惯用动物急性毒性试验所得出LD50或LC50来表示。化学毒物急性毒性与LD50呈反比，即急性毒性越大，LD50数值越小。

经口、经皮毒性用LD50表示，单位mg/kg·BW)；

吸入毒性或对水生动物毒性用LC50表示，单位mg/m3或mg/L。药物毒理学讲座第16页

LD50或LC50是评价化学毒物急性毒性大小最主要参数，也是对不一样化学毒物进行急性毒性分级基础标准。我国农药急性毒性分级级别经口LD50(mg/kg·WB)经皮LD50(mg/kg·WB)4h吸入LC50(mg/m3)2h剧毒＜5＜20＜20高毒5~20~20~中等毒50~500200~200~低毒＞500＞＞药物毒理学讲座第17页化学物质急性毒性分级级别大鼠口服LD50(mg/kg·WB)相当于人致死剂量(mg/kg·WB)(g/人)极毒＜1稍尝0.05剧毒1~50500~40000.5中等毒51~5004000~300005低毒501~500030000~25000050实际无毒5001500000500无毒＞15000＞5000002500药物毒理学讲座第18页反应化学物质急性毒性大小指标还有：

最大无作用剂量(NOEL)；

最小有作用剂量(minimaleffctlevel，MEL)，又叫中毒阈剂量(thresholddose)

，或中毒阈值，或毒性阈值；

最大耐受剂量(maximaltolerancedose,MTD,LD0)

最小致死剂量(LD1)；

绝对致死剂量(LD100)。

药物毒理学讲座第19页

6.剂量—反应关系(dose-responserelationship)表示化学毒物剂量与某一群体中质效应发生率之间关系。

7.

剂量—效应关系(dose-effectrelationship)表示化学毒物剂量与个体

或群体中发生量效应强度

之间关系。药物毒理学讲座第20页

安全系数种属差异,动物试验,外推到人。

试验组不一样剂量组

阴性对照组

阳性对照组为何设阴性、阳性对照组？

样本含量标准：既符合统计学要求,又不致人力、物力、财力、时间浪费。

统计学处理计量资料;计数资料药物毒理学讲座第21页医药药效学农药研究产业性化学物毒理学(五)药品研究●药效学研究●毒理学研究二者均须经过动物试验、流行病学、临床研究方法进行研究，但毒理学研究主要采取动物试验。药物毒理学讲座第22页(六)

毒理学安全性评价

我国现有毒理学安全性评价程序：

《食品安全性毒理学评价程序》

《农药安全性毒理学评价程序》

《新药(农药)毒理学研究指导标准》

《化装品安全性毒理学评价程序》

《化学品毒性判定管理规范》(入世为与国际接轨颁布)

试验室研究质量规范(goodlaboratorypractice,GLP)，对毒性判定机构认证、试验室要求作出明确要求。药物毒理学讲座第23页对不一样化学品(食品添加剂、药品、农药、化装品、工业化学物等)，因为接触方式、路径、剂量不一样，按照不一样国家标准，采取不一样行业规范程序进行评价。药物毒理学讲座第24页毒理学安全性评采取分阶段试验标准(考虑急性危害、慢性危害、远期危害)。各阶段试验之间相关联，要按次序进行。

如急性毒性试验是全部毒理学试验基础；

慢性毒性试验剂量、观察指标选择要参考亚慢性毒性试验结果。

依据前一阶段试验结果，判断是否进行下一阶段试验。药物毒理学讲座第25页

不一样阶段毒理学试验项目

我国现有毒理学评价程序多数为4个阶段。《化装品安全性毒理学评价程序》为5个阶段。

新药研究分为全身用药毒性试验、局部用药毒性试验、特殊毒理研究，三部分。

化学物种类不一样，用途不一样，试验方法和先后次序不一样(如化装品、食品，口皮急毒次序不一样)。药物毒理学讲座第26页

第一阶段，包含：

♫

急性毒性试验；

♫

局部毒性试验。

目标：主要是测定LD50或LC50，并进行急性毒性分级，为其它试验提供剂量参考依据，并推测靶器官。

农药、化装品要进行

♫

皮肤、黏膜刺激试验；

♫

眼刺激试验；

♫

皮肤致敏试验；

♫

皮肤光毒试验；

♫

光变态反应试验。药物毒理学讲座第27页第二阶段，普通包含：

♫

蓄积试验；

♫

致突变试验。

目标：了解与受试物屡次接触后体内蓄积情况以及可能危害，并判断是否含有致突变性进而预计致癌性。

蓄积试验，以死亡为指标，有一定不足，当前有些评价程序已经去掉。

致突变试验，包含各种组合，以观察不一样遗传终点。药物毒理学讲座第28页一些受试物在第一、第二阶段试验后，可决定是否进行下一阶段试验。

如引进产品、生产工艺，国外已经登记注册，毒性资料全方面，其质量规格、生产工艺、与国外产品一致，进行第一阶段和第二阶段结果与国外一致，能够不进行第三、第四阶段试验。药物毒理学讲座第29页

第三阶段，包含：

♫亚慢性毒性试验；

♫生殖及发育毒性试验；

♫代谢试验。

亚慢性毒性试验目标：确定重复接触受试物所引发毒性效应、强度、靶器官，初步预计NOAEL或LOAEL，为慢性毒性试验和致癌试验提供剂量、指标参考依据。

生殖发育毒性试验包含：致畸试验；繁殖试验。目标：观察对生殖过程影响。

代谢试验目标：了解受试物在体内吸收、分布、消除情况，判断蓄积性。药物毒理学讲座第30页

第四阶段，包含：

♫慢性毒性试验；

♫致癌试验。

目标：取得NOAEL或LOAEL，

为制订卫生标准提供参考数据。

特点：时间长、费人力物力。药物毒理学讲座第31页

(七)药品毒理学研究发展

伴随医学科学和医药工业进步和发展，研制和开发了大量新药，对医治人类疾病,保障人类健康起到了巨大作用。

但因为1961年反应停(thalidomide)药害事件发生，使28国家中出生了8000多短肢畸形儿，引发世界各国极大关注，使医学界首次认识到对母体安全化学药品对胎儿产生不可逆损伤。由此揭开药品和其它环境化学毒物致畸研究序幕。人们在要求药效同时，更注意其安全性。药物毒理学讲座第32页一个药品药理概况，决定于临床前药理和毒性研究，在供使用前必需了解预期药效、药理性质、毒性作用，有利于显示其使用安全性。药品安全性，是确保药品质量主要步骤，伴随新药国际化，国际间相互利用安全性试验数据也日益增加。药物毒理学讲座第33页为此，英国1968年颁布药品法，1971年成立了药品检定机构和药品安全委员会。今后，在药品市场经济推进下，许多发达国家开始重视药品和其它化学品对人类生殖影响，首先是致畸性(teratogenicity)，WHO于1967年在国际疾病分类中把先天缺点列为第14项，分20大类、133小类。同时，研究怀孕至出生之间胚胎/胎儿异常发育畸胎学(teratology)创建。1981年OECD(经济合作和发展组织)制订了“化学物质毒性试验指导标准”，该指导标准不但对药品也包含普通产业性化学物质，使毒性试验规范化。药物毒理学讲座第34页药物毒理学讲座第35页药物毒理学讲座第36页药物毒理学讲座第37页药物毒理学讲座第38页

(七)新药研究过程

大致可分三步：即临床前研究、临床研究和售后调研。

1.临床前研究

用动物试验进行系统药理研究和急慢性毒理观察，对于含有选择性药理效应药品，在进行临床试验前，还需测定该药品在动物体内吸收、分布及消除过程(药代动力学)，故临床前研究目标是搞清新药作用谱(药效)及可能发生毒性反应(毒作用特点)。药物毒理学讲座第39页

2.临床研究

首先从10～30名志愿者中找出安全剂量(依据动物试验结果，安全系数)，再选有特异特征病人随机分组，设置已知有效药品及空白抚慰剂双重对照(阳、阴性对照),对治疗结果统计分析，判断其疗效。

3.售后调研

重点了解长久使用后出现不良反应和远期疗效(流行病学研究)。药物毒理学讲座第40页(八)新药药理毒理研究技术要求

新药药理毒理研究包含主要药效学、普通药理学、药代动力学及毒理学研究等。药物毒理学讲座第41页新药药效研究，以医药理论为指导，利用当代科学方法，制订含有医药特点试验方案，依据新药功效主治，选取或建立对应动物模型和试验方法，其目标是对新药有效性评价提供科学依据。

新药毒理研究包含急性毒性、长久毒性和特殊毒性试验等，其目标是对新药安全性评价提供科学依据。药物毒理学讲座第42页

基本要求

1.试验主要责任人应含有药理毒理专业高级技术职称和有较高理论水平、工作经验与资历。确保试验设计合理，数据可靠，结果可信，结论判断准确。试验汇报应有试验责任人签字及单位盖章。

2.受试药品应处方固定、制备工艺及质量基本稳定。

3.从事新药安全性研究试验室应符合国家药品监督管理局《药品非临床研究质量管理规范》(GLP)要求，药理研究也可参考实施。药物毒理学讲座第43页

全身性用药毒理试验

1．急性毒性试验

观察一次给药后，动物产生毒性反应并测定其半数致死量(LD50)。

要用两种以上给药路径(包含推荐临床研究给药路径，溶于水药应该测定ivLD50)。给药后最少观察7d，观察到动物有毒性反应时应进行肉眼尸检，统计全部病变。存活24h或更长时间处理动物，当尸检发觉有病变组织时，应对该组织进行镜检。药物毒理学讲座第44页

2．长久毒性试验

观察动物因连续用药而产生毒性反应、中毒时首先出现症状及停药后组织和功效损害发展和恢复情况。药物毒理学讲座第45页

(1)动物：最少两种动物(包含啮齿类和非啮齿类)，啮齿类惯用大白鼠，年纪为6W，喂养观察1W后使用，动物数按毒性试验时间长短决定，如毒性试验时间＜90d，每剂量组为雌雄各10只。如毒性试验时间＞90d，每剂量组为雌雄各20只。非啮齿类惯用狗，年纪为4~6月，每剂量组为雌雄各2只。对照组和试验组动物数要相等。药物毒理学讲座第46页

(2)剂量：惯用三个剂量，大动物也可用两个剂量。在试验过程中，高剂量组应有部分动物出现毒性反应或死亡(≯20％)，低剂量组应该略高于药品对动物有效量或临床试验用剂量而不出现任何观察指标异常。药物毒理学讲座第47页

(3)给药路径：注射用药给药路径应与推荐临床试验给药路径相同，口服给药最好采取灌胃法。药物毒理学讲座第48页

(4)试验周期：普通参考推荐临床试验用药连续时间考虑，即动物试验连续给药期必须为临床试验给药期3~4倍。比如，临床试验给药期为1~3d者，毒性试验给药期为2W。7d者，为4W。30d者，为3月。＞30d者，毒性试验给药期最少六个月。

试验周期在六个月以上新药，可在长久毒性试验进行3个月后、未发觉显著毒性反应情况下，申请进行第Ⅰ期临床试验。药物毒理学讲座第49页

(5)观察指标：普通体征、体重、外观、行为、尿常规、血常规、肝肾功效及主要器官肉眼观察和病理检验，必要时作骨髓检验，血液生化，大动物应检验心率和心电图改变。凡有可能引发眼、耳毒性药品，应增加眼、耳毒性检验指标。有些药品尚需研究对酸碱平衡、水盐代谢影响。药物毒理学讲座第50页产生毒性反应新药最少应对高剂量组和对照组动物在给药期结束后继续进行观察，对引发不可逆性功效损害和组织病变药品，要慎重考虑临床试验问题。药物毒理学讲座第51页对毒性较高、安全范围较小特殊品种新药，如拟进行临床试验，最好经过研究找出一个解救药，以备过量中毒时使用。药物毒理学讲座第52页有新药还应依据其药理性质和用途，观察对注射部位(皮下、肌肉、血管)刺激性，注射用生化制品应进行热原、异性蛋白及过敏试验。药物毒理学讲座第53页

(二)局部用药毒性试验

局部用药(如呼吸道吸入以及粘膜、皮肤用药等)，大都能够被吸收。所以，局部用药应先进行局部吸收试验，依据药品从局部吸收程度，考虑进行全身性用药各项试验。依据用药方法，对用药部位要进行局部刺激性试验，用肉眼观察及组织切片镜检，测试刺激性(即炎症)发展和恢复情况。药物毒理学讲座第54页

1．皮肤用药进行完整和破损皮肤毒性试验以及皮肤致敏试验，除婴儿皮肤用药应使用刚成年动物外，其余均用成年动物。可选取家兔、豚鼠或大鼠。最少应设三个剂量组，每组动物数≮3只，以观察与剂量相关毒性反应。观察期普通在停顿敷用后不超出14d。药物毒理学讲座第55页

2．滴鼻剂和吸入剂进行呼吸道(包含肺部)局部刺激性和毒性试验。大鼠或豚鼠。每一个浓度组最少10只动物(雌雄各半)，最少设3个浓度组。接触吸入剂时间不少于4h。观察期普通为14d。药物毒理学讲座第56页

3．滴眼剂观察对眼结合膜和眼球刺激作用。家兔为首选，最少用3只家兔。液体制剂剂量普通每次用0.1ml，软膏等制剂每次≯100mg。观察期普通在停顿给药后21d内，以观察出现反应可逆性和不可逆性。药物毒理学讲座第57页

4．局部作用于直肠、阴道制剂，进行对作用部位刺激及局部毒性试验。药物毒理学讲座第58页

(三)特殊毒理研究

1．致突变试验依据受试物化学结构、理化性质及对遗传物质作用终点(基因突变和染色体畸变)不一样。要求新药必须做以下三项试验：药物毒理学讲座第59页

(1)微生物回复突变试验

菌株：组氨酸缺点型鼠伤寒沙门菌四株(TA97、TA98、TA100、TA102)，亦可采取大肠杆菌(E.Coli)WP2若干株(大肠杆菌试验)。药物毒理学讲座第60页

剂量选择：决定受试物最高剂量标准是细菌毒性和溶解度。普通最大剂量可达5mg/皿。受试物最少应有5种不一样剂量，不然应说明选择剂量理由。

代谢活化：应有诱导剂处理后哺乳动物肝脏微粒体(S9)进行体外代谢活化试验，即在加S9混合物和不加S9混合物平行条件下测试。

对照组：用溶媒作阴性对照，用已知突变原作阳性对照。药物毒理学讲座第61页

结果判定：受试物回复突变菌落数增加与剂量相关并有统计学意义，或最少某一测试点展现可重复并有统计学意义阳性反应时记为阳性。药物毒理学讲座第62页

(2)哺乳动物培养细胞染色体畸变试验

细胞：哺乳动物原代或传代培养细胞。

剂量：最少应有三种不一样剂量，高剂量以50％细胞生长抑制浓度为基准，不然应说明选择剂量理由。

标本制作时间：药品与细胞接触后应有适当初间，最好包含整个细胞周期，通常在药品处理后24和48h制作染色体标本。药物毒理学讲座第63页

代谢活化：应用适当代谢活化法。

对照组：用溶媒作阴性对照，已知突变原作阳性对照。

镜检：每种浓度最少观察100个中期分裂相细胞染色体结构异常及多倍体出现率。

结果判定：受试物诱发染色体畸变出现率较阴性对照有统计学意义增加，并有剂量反应关系时记为阳性，同时标明异常细胞出现频率和种类。药物毒理学讲座第64页

(3)体内试验：普通选取微核试验，但作用于生殖系统药品进行显性致死试验等。药物毒理学讲座第65页

1)啮齿类动物微核试验

动物：普通用小鼠，每组10只性成熟动物(♀♂各半)或最少6只性成熟♂动物。

给药剂量及路径：最少采取三种剂量，最高剂量以1/2LD50为基准，腹腔和/或口服一次给药，必要时可连续给药、不然应说明选定剂量理由。

对照组：用溶媒作阴性对照，已知能诱发微核阳性物质作阳性对照。药物毒理学讲座第66页

标本制作：给药后18~30h或12~72h处死动物，取骨髓，离心，涂片，Giemsa染色或吖啶橙染色。

镜检：每只动物最少观察计数1000个多染红细胞和正染红细胞比率。

结果判定：微核细胞出现频度与对照组相比有统计学意义增加，并有剂量反应关系时，或同一剂量有重复性并有统计学意义时记为阳性。药物毒理学讲座第67页

2)啮齿类动物显性致死试验

动物：性成熟啮齿类动物，普通采取小鼠。每组最少15只♂鼠。

给药剂量及路径：最少采取三种剂量，但在早期评价中单剂量或二种剂量即可。高剂量以30d连续给药使100％动物生存最大耐受量为基准。口服或腹腔注射可采取一次给药，天天给药一次，连续给药5d或连续给药6W方法之一。药物毒理学讲座第68页

交配方法：给药♂♂动物以适当时间间隔依次与未给药♀动物交配，交配时间取决于给药方式，普通一次或连续给药5d动物，以最终给药后6W内为交配时间；连续给药6W动物以最终给药后1W内为交配时间。药物毒理学讲座第69页

对照组：用溶媒作阴性对照，已知能诱发显性致死阳性物质作阳性对照。但在同一试验室，对同一品系动物，可不设阳性对照。

观察指标：交配♀动物在妊娠后期剖腹，观察子宫内胚胎着床数，生存胎仔数，死亡胎仔数及未着床数。显性致死率以DL表示：

DL(100％)＝[1－(试验组妊娠鼠平均生存胎仔数/阴性对照组妊娠鼠平均生存胎仔数)]×100药物毒理学讲座第70页

结果判定：死亡胎仔数增加，胚胎着床总数降低，或未着床胚胎数增加，生存胎仔总数降低，这些结果有统计学意义并有剂量反应关系时记为阳性显性致死效应。

当上述三项致突变试验结果难以下结论时，可选择其它补充试验给予确证。药物毒理学讲座第71页

2．生殖毒性试验所用药品最少应有2~3种剂量并设对照组。高剂量可产生轻度毒性反应，低剂量应为人临床拟用剂量若干倍。给药路径标准上与推荐临床应用给药路径相同，口服制剂应用灌胃法。药物毒理学讲座第72页

(1)普通生殖毒性试验

动物：一个或一个以上试验动物，如用小鼠或大鼠每组♀♂各20只以上。

给药时期：选择性成熟动物，交配前♂动物连续给药60d以上，♀动物连续给药14d。♀动物在确定已经交配后继续给药至多数胚胎器官发生期。药物毒理学讲座第73页

检验：给药♀动物与给药♂动物同笼喂养期限最多2W。必要时给药动物能够和非给药动物分别交配。已交配雌性动物，推定其妊娠末期及时解剖，观察妊娠确实立、胎儿吸收和死亡及子宫内活胎发育情况，并进行形态学检验(性别、外表及内部器官形态学观察及骨骼透明标本检验)，必要时进行组织学和组织化学详细检验。给药♂动物及未交配上♀鼠均作剖检，必要时进行病理组织学检验。药物毒理学讲座第74页

(2)致畸胎试验

动物：最少一个动物。普通采取小鼠或大鼠，每组15~20只孕鼠，家兔每组8~12只孕兔。

剂量：最少有2~3种剂量。并另设对照组，高剂量可有轻度毒性反应，低剂量应以拟议中治疗量一些倍量。

给药路径：与推荐临床应用给药路径相同，口服制剂应用灌胃法。

给药时期：胚胎器官形成期。药物毒理学讲座第75页

检验：全部动物在妊娠末期剖检，观察妊娠确实立，有没有死胎和吸收胎及子宫内活胎发育情况，并进行形态学检验(性别、外表及内部器官形态学观察及骨骼透明染色标本检验)，必要时进行组织学和/或组织化学详细检验。药物毒理学讲座第76页一些新药需要观察其对子代影响。动物数对应增加孕鼠10只，使其自然分娩，观察下一代直至成年。检验新生动物存活、生长及发育情况，包含行为、生殖功效和其它异常症状。必要时还可对给药♀动物长久观察其生殖、受孕、分娩及次子代情况。药物毒理学讲座第77页

结果处理：将数据汇总成表，尽可能将全部观察结果采取适当统计学方法分析及评价。药物毒理学讲座第78页

(3)围产期毒性试验

动物：小鼠或大鼠，每组15~20只孕鼠，家兔每组8~20只孕兔。

给药时期：妊娠后期及整个泌乳期。

检验：全部♀动物自然分娩，观察下一代直至成年，检验其新生后存活、生长和发育情况，其中包含行为、生殖功效及其它异常症状。必要时还可对给药♀动物长久观察其生殖、受孕、分娩及次子代情况。药物毒理学讲座第79页

3．致癌试验在选择动物种系时，应考虑其对感染疾患抵抗性、寿命、自发肿瘤频度系对致癌物敏感性。同一药品致癌性预备试验及致癌试验应该用同一喂养场喂养同一个和系动物。啮齿动物给药时间，最好在断乳后尽早开始。药物毒理学讲座第80页

(1)致癌试验预备试验：应由急性毒性试验决定亚急性毒性试验最高剂量，由亚急性毒性试验决定致癌试验最高剂量，此剂量应含有：试验和对照组之比，体重增加抑制＜10％；无中毒死亡动物；普通形态改变不大。药物毒理学讲座第81页啮齿类动物每组♀♂各10只，设三个试验组及一个对照组。给药路径应与进行致癌试验时准备采取路径一致，连续给药90d。对有慢性蓄积性效应药品，需延长给药期。药品混入饲料或饮水中给药方式，要定时测定饲料或饮水消耗量，以推算出药品摄取量。药物毒理学讲座第82页天天观察动物普通情况，每七天测量动物体重，对死亡动物及试验期末动物均需作大致解剖，并作病了解剖统计。肉眼观察后，认为有病变或可疑病变脏器进行病理组织学检验。药物毒理学讲座第83页

(2)致癌试验

动物：试验组和对照组动物♀♂各50只以上。

剂量：最少应有三种以上剂量，一定要有溶媒或赋形剂对照组。

给药期：大鼠为24月以上，小鼠、地鼠为18月以上。药物毒理学讲座第84页

观察指标：对全部动物天天应观察普通症状，开始时每七天测一次体重和摄食量，第13W后，最少每4W测一次。应尽可能降低肿瘤以外死亡率。大鼠在试验24个月，小鼠、地鼠18个月时，各组存活率大于50％。试验期末解剖或怀疑有血液疾患时，最好做末梢血液白细胞及红细胞计数。药物毒理学讲座第85页假如在试验组和对照组肉眼观察到有肿瘤性病变或可疑肿瘤病变时，则应对以下器官进行病理组织学检验：皮肤、乳腺、淋巴结、唾液腺、胸骨、脊椎及大腿骨(含有骨髓)、胸腺、气管、肺及支气管、心、甲状腺及副甲状腺、舌、食管、胃、十二指肠、大肠、小肠、肝、胰、脾、肾、肾上腺、睾丸、卵巢、性腺及其从属器官、眼球、脑下垂体、脊髓及其它。药物毒理学讲座第86页假如试验组和对照组均无肉眼可见肿瘤性病变，则对高剂量组部分动物(1/2~1/3)上述器官进行病理组织学检验，如发觉有肿瘤病变则需对全部动物进行病理组织学检验。药物毒理学讲座第87页

结果判断：符合以下情况之一者判断为阳性：①试验组肿瘤阳性，对照组阴性；②试验组和对照组都有肿瘤发生，但试验组肿瘤发生率高于对照组；③试验组肿瘤发生部位多于对照组；④试验组和对照组肿瘤发生率虽无显著差异，但试验组肿瘤出现早。药物毒理学讲座第88页

(3)评价：假如在一个动物中发觉有明确致癌作用，预示对人可能有致癌潜力。假如在全部动物中(最好两种)都是阴性结果，则可判为阴性。药物毒理学讲座第89页二、药品临床前毒性试验★

(一)目标

剔除毒性大化学物，找出发生不良反应靶器官和靶组织，方便在早期临床试验中注意观察这些器官和组织结构及功效改变，最好还要找出这些不良反应与剂量和疗程间关系，毒性作用是可逆，还是不可逆，是能够预防，还是不可防止，假如能证实毒作用机制，就能够更准确地预测药品对人体毒性(但要考虑其不良反应是否与超剂量—反应界限，就会出现与药理作用范围内剂量缺乏联络毒性反应)。药物毒理学讲座第90页

(二)试验标准

●单次给药毒性试验

●重复给药毒性试验

●生殖、发育毒性试验

●致突变试验

●致癌试验

●皮肤过敏试验

●皮肤光敏性试验药物毒理学讲座第91页

1.单次给药毒性试验

又称急性毒性，指一次给药。

目标:一次给予受试物后，从质与量两方面证实其毒性。药物毒理学讲座第92页动物物种选取标准★

①解剖结构、生理生化、化学物

在体内代谢与人类近似；

②经济可行；

③有符合试验要求寿命长度；

④便于喂养管理。药物毒理学讲座第93页惯用毒理学试验动物选择★

●普通毒性试验常选大鼠、小鼠；

●眼刺激试验常选家兔；

●皮肤刺激试验常选家兔、豚鼠；

●

致敏试验和光敏试验常选豚鼠；

●

生殖发育毒性试验常选大鼠；

●

致癌试验常选大鼠……

药物毒理学讲座第94页

动物数量确定标准

即统计学中样本含量问题，既要符合统计学要求，又不致人力、物力、财力、时间浪费。药物毒理学讲座第95页动物性别确定标准

最少一个，♀♂各半。一些特殊试验例外，如致癌试验可只用♂性动物。药物毒理学讲座第96页

给药路径选择标准★

与人类实际接触路径一致。药品毒理学研究给药路径同临床。

但：临床po、iv，动物只iv。药物毒理学讲座第97页单次给药毒性试验动物要求：两种以上，啮齿类动物(每组5只)，非啮齿类(2只)，要求二级以上动物(即喂养于简易屏障系统，无危害动物种群微生物和寄生虫,为我国当前合格标准试验动物)。

性别：最少一个，♀♂各半。药物毒理学讲座第98页

路径：临床po、iv，动物只iv。

剂量：设计剂量组能全方面掌握毒性剂量范围，要求能求出近似致死量足够剂量范围，不一定LD50，非啮齿类要求能观察到出现显著毒性症状剂量范围，并希望能显示出剂量—反应关系。(近似致死量：因用动物量少，剂距大，求出死亡率只能近似致死量，以xx～xxmg/kg范围表示)。

观察期：14d，死亡和存活动物均应剖检，异常者要做病理组织学检验。药物毒理学讲座第99页惯用LD50计算方法

●Horn(霍恩)氏法(又叫平均移动法、剂量递增法)

●寇氏法和改进寇氏法

●概率单位法

●序贯法(又叫平均数法、阶梯法、上－下法)

●Bliss法(又叫最大似然性法)药物毒理学讲座第100页LD50计算方法之—Horn氏法介绍

原理

Horn氏法，又叫平均移动法、剂量递增法，是利用剂量对数与死亡率(反应率)转换数(即几率单位)呈直线关系而设计方法。

优缺点使用动物数少；可直接从Horn氏表查出LD50及其95％可信限，不需计算，甚为简便。但LD5095％可信区间范围较大，方法准确度尚不够。药物毒理学讲座第101页

Horn氏法设计标准★

4个剂量组；每组动物数相等；每组4只或5只；设计剂量时可依据化学物致死剂量范围宽窄应用两个剂量系列，其组距分别为2.15倍和3.16倍。依据每组动物数、组距和每组动物死亡数，即可从Horn氏表中查得LD50及其95％可信限。

见《MicrosoftPowerPoint－霍恩法.ppt》药物毒理学讲座第102页

2.重复给药毒性试验(包含亚急性和慢性毒性试验)

目标：观察剂量与反应时间关系和首次出现毒性改变及停药后组织和功效损害发展和恢复情况。

动物和性别：同单次给药毒性试验。

动物数：♀♂各半,每组≥10只(非啮齿类3只),如试验中要活杀,则要追加动物数。若毒性试验＞90d,♀♂各20只。

路径：同临床。

给药期：见表1，普通约为临床试验用药3～9倍。药物毒理学讲座第103页表1重复给药毒性试验给药期临床拟给药期动物试验给药期(月)单次或连续1W1＞1W或4W内连续给药3＞1月或6个月连续给药6＞6个月或蓄积性12药物毒理学讲座第104页

剂量组别：最少3组(高剂量组有部分动物出现毒性反应或死亡≯20％)(毒性反应剂量、无毒性反应剂量、临床试用剂量)。对照组：溶媒对照,必要时设空白、阳性对照。观察指标：①普通情况：(体重、摄食量、饮水量)；②血、尿常规；③生理指标：如心、视、听等功效；④大致解剖、病理组织学检验。药物毒理学讲座第105页

3.生殖、发育毒性试验将妊娠前到离乳期分为三个试验阶段：①妊娠前及妊娠早期；②胚胎器官形成期；③围产期及授乳期)。以掌握对生殖、发育影响。要求三个阶段试验动物种系要统一，应选择受孕率高、自畸率低、对阳性物敏感动物。药物毒理学讲座第106页

⑴妊娠前及妊娠早期给药试验

动物：大鼠、小鼠任选一个(大鼠胎盘结构更靠近人)，♀♂各20只。

给药路径：同临床。

剂量组别：3个剂量组、对照组(阳性、阴性、比较对照。后者指化学结构或药效与受试物相同已知物质)。给药期：♂出生后40d连续给药60d以上，交配，直至交配成立止，♀成熟动物14d以连续给药后交配，怀孕直到胚胎器官形成早期为止,大鼠(受孕0～7d)小鼠(0～6d)。试验方法：同致畸试验。观察身长、体重及头颅、肢体等有没有畸形。药物毒理学讲座第107页

⑵胚胎器官形成期给药试验

动物数：每组孕鼠30只以上。

给药期：大鼠受孕后7～17d，小鼠6～15d。⑶围产期及授乳期给药

动物数：大小鼠每组20只以上。

给药期：大鼠受孕后17～分娩后21d，小鼠受孕后15～分娩后21d，观察子代至成年存活、生长和发育(展)情况。药物毒理学讲座第108页

4.致突变试验：

标准上要进行：①细菌回复突变试验；②培养细胞染色体畸变试验；③啮齿类动物微核试验(体内试验)。

药物毒理学讲座第109页

5.致癌试验

凡长久使用新药或依其结构和药理作用怀疑致癌性应进行试验,但对用于罕见及难治疾病药品,而且在临床使用,利大于弊时,可不受致癌性影响。

⑴试验动物：应考虑对疾病抵抗力、寿命、自发肿瘤发生率和已知对致癌性物质敏感性等。

药物毒理学讲座第110页

⑵试验方法：依据单次给药和重复给药结果决定剂量。高剂量要求与对照组比较10％以内体重增加受抑制，但不出现显著毒性改变，没有中毒死亡，此结果能够经过预试验取得。

1)动物：2种以上，♀♂各半(多用大、小鼠)6W龄以下动物(最好同一周龄)。

2)动物数：♀♂各50只。

3)给药路径：同临床。药物毒理学讲座第111页

4)剂量组：应设3组以上：

①高剂量组按上述要求设剂量，低剂量标准上应展现药效或依据临床拟给药剂量决定，中间组是高、低剂量等比中项。

②当与临床治疗比较毒性很低时，高剂量可按临床拟给药剂量100倍设计。

③低剂量应是高剂量10％以上，当其量显著偏离临床拟给药量时，可设计不足高剂量10％剂量。

④混入饲料或饮水中给药(自然经口摄入)时，前三个月每七天测一次摄入量和饮水量，以后每三个月测一次，以计算受试物摄入量。

药物毒理学讲座第112页

5)对照组：阴性对照给受试物溶媒或乳化剂；空白对照。

6)给药期：大鼠24～30月,小鼠18～24月，连续给药，灌胃给药可给5d停2d。

7)试验期：大鼠最长30月,小鼠和仓鼠24月,当低剂量组或对照组动物累积死亡率达75％时,应全部剖杀。试验期间要求各组存活率≮50％。

8)试验方法：称体重前3月1次/W，以后每个月1次，死亡动物及时剖检(病理)，试验结束应剖检高剂量组，发觉靶器官方便有目标检验。

药物毒理学讲座第113页

9)结果判断

①试验组肿瘤阳性,对照组阴性(有与无)；

②两组都有肿瘤,试验组>对照组(P<0.05)(多与少)；

③试验组肿瘤发生部位多于对照组(部位多少)；

④两组肿瘤发生率无差异,试验组出现早(早与晚)。药物毒理学讲座第114页

6．皮肤过敏试验(针对外用药品)

1)剂型：液体、半固体可直接用，固体应用水或溶媒湿润后用。

2)动物：豚鼠，每组5只。

试验组：①受试物涂敷组；②阳性对照(1-氯-2,4-二硝基苯)；③阴性对照(空白、基质、乳化剂)。

药物毒理学讲座第115页

试验步骤

①背部皮肤脱毛(2×4cm)；

②将蒸馏水、受试剂、溶剂0.1ml±对称皮内注射；

③1W后在皮肤注射部位涂敷月桂醇硫酸钠(1％凡士林),次日在同一部位帖敷封包0.2ml/0.2mg(液/固)受试物;

④激发致敏结束2W后，同一部位帖敷受试物24h；

⑤评价：去帖敷后24、48h观察皮肤反应,以红斑、水肿程度、频率与阳性对照、阴性对照比较。

药物毒理学讲座第116页

7．皮肤光敏性试验

方法同皮肤过敏试验，只是在致敏后3W，于豚鼠背部一侧以锡纸遮光，以10Joales/cm2紫外线照射。

药物毒理学讲座第117页

三、药效试验研究基本要求

1.掌握药品化学结构和理化特征。

2.以整体动物体内试验为主，试验动物应符合国家要求等级动物要求(二级，即清洁级动物：喂养于简易屏障或隔离系统，应排除对动物有危害微生物和寄生虫，即按我国国情采取过渡级别。发达国家用三级，即无特定病原体动物)，必要时配合体外试验，从不一样层次证实其药效，充分证实其主要治疗作用以及较主要其它治疗作用。动物模型应符合治疗病征。

药物毒理学讲座第118页

3.观察指标：应选取特异性强、敏感性高、重现性好、客观、定量或半定量指标进行观察，对试验方法应作详细叙述。

4.给药量及路径

剂量：应设两个组,其中一个剂量相当于临床剂量2～5倍(小鼠10～15倍)，大动物可仅设一个剂量，药效试验量不应高于长久毒性试验剂量。

路径：二种，一个与临床相同。

药物毒理学讲座第119页

5.对照药：

空白对照：正常及模型动物对照组，必要时设溶媒对照。

阳性药品对照：应选择药典受载或部颁标准或正式同意生产药品，其药品应与新药主治相同，功效相同，给药路径及剂型相同。

6.普通药理研究：即药效以外其它作用，主要观察神经系统、心血管系统、呼吸系统。

7.药代动力学研究：包含吸收、分布、排泄。

8.试验结果应进行统计处理。

药物毒理学讲座第120页

四、药效学试验举例

㈠抗炎试验

试验材料

药品：

①坤泰安；

②阿斯匹林：北京制药厂生产,批号8207115；

③琼脂：上海化学试剂采购供给站试剂厂，日本进口分装，批号760220。

药物毒理学讲座第121页

方法与结果

1.坤泰安对琼脂所致大鼠足跖肿影响

试验用健康大鼠40只,♀♂兼用，随机分5组：①生理盐水对照组；②