流式细胞仪原理和一般用法专家讲座

Partec-ExcellenceinFlowCytometry超出41年研发经验流式细胞仪原理

流式细胞仪使用普通方法及技巧流式细胞仪原理和一般用法专家讲座第1页Partec-ExcellenceinFlowCytometry超出41年研发经验流式细胞术流式细胞分析，又称流式细胞术（flowcytometry，FCM），是以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色单细胞或微粒，测量其产生散射光和发射荧光强度，从而对细胞（或微粒）物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功效状态等进行定性或定量检测一个当代细胞分析技术。他综合了激光技术、计算机技术、半导体技术、流体力学、细胞化学等各门学科。流式细胞仪原理和一般用法专家讲座第2页Partec-ExcellenceinFlowCytometry超出41年研发经验流式细胞术流式细胞分析，又称流式细胞术（flowcytometry，FCM），是以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色单细胞或微粒，测量其产生散射光和发射荧光强度，从而对细胞（或微粒）物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功效状态等进行定性或定量检测一个当代细胞分析技术。他综合了激光技术、计算机技术、半导体技术、流体力学、细胞化学等各门学科。流式细胞仪原理和一般用法专家讲座第3页Partec-ExcellenceinFlowCytometry超出41年研发经验特点：（1）单细胞分析。（2）快速分析。（3）多参数相关测量。（4）定性或定量分析细胞。（5）统计学意义显著。（6）分选。流式细胞仪原理和一般用法专家讲座第4页Partec-ExcellenceinFlowCytometry超出41年研发经验荧光有些物质，当用光照射时，它吸收了该种波长光后还会发射出各种颜色和不一样强度光，而当光停顿照射后，这种发射光也随之消失，这种发射光称为荧光(fluorescence)。荧光波长比吸收光线波长要长些。因为物质分子结构不一样，所吸收光和所发射荧光波长也不一样。被这些物质吸收光称为激发光，产生发射光即荧光。荧光颜色多为红、蓝、绿或黄等。物质荧光有两种，一个是自发性荧光，即组织在短波长光照射下自行发射出荧光。如，组织中蛋白质和脂类在紫外线照射下能发射出微弱淡蓝色荧光。另一个荧光是诱发荧光，即细胞与荧光色素结合后，经一定波长光线照射后发出荧光。惯用是诱发荧光，能产生荧光生物染色剂称为荧光染料(或称荧光色素)。流式细胞仪原理和一般用法专家讲座第5页Partec-ExcellenceinFlowCytometry超出41年研发经验荧光激发与发射原理能量级激发激发态发射激光能量损失流式细胞仪原理和一般用法专家讲座第6页Partec-ExcellenceinFlowCytometry超出41年研发经验免疫荧光技术免疫荧光技术是依据抗原—抗体反应原理，先将已知抗原或抗体标识上荧光素，制成荧光抗原或抗体，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检测细胞表面或细胞内对应抗原(或抗体)。从而使形成抗原—抗体复合物上含有标识荧光素，利用流式细胞仪检测标本，荧光素受外来激发光照射而发生明亮荧光(如，黄、绿色或红色等)，经过确定抗原或抗体性质、定位来推断细胞信息，以及利用定量技术测定含量。惯用方法：单抗直接标识流式细胞仪原理和一般用法专家讲座第7页Partec-ExcellenceinFlowCytometry超出41年研发经验嵌入性染料如DAPI、赫斯特、PI等，直接与细胞内DNA双螺旋结构中A-T碱基对结合，从而使细胞在激发光照射下发特定波长光，经过判断发射光强弱来推算A-T碱基正确多少，从而得知DNA倍性关系。流式细胞仪原理和一般用法专家讲座第8页Partec-ExcellenceinFlowCytometry超出41年研发经验细胞膜电位、离子、脂类探针现已发觉或开发出来了各种细胞膜电位、各类离子、pH值、脂类探针，利用这些探针在流式细胞仪上可轻易检测各种细胞功效，可实现一些意想不到效果。详细信息，见细胞探针企业网站：

www.molecularP流式细胞仪原理和一般用法专家讲座第9页Partec-ExcellenceinFlowCytometry超出41年研发经验与流式细胞仪相关荧光术语MESF（Moleculesofequivalentsolublefluorochrome）等量可溶性荧光分子：国际标准单位，用来衡量荧光强度自发荧光：细胞或颗粒在激发照射下会发出各种波长荧光。白细胞自发荧光强度为650~1150MESF，血小板及其它颗粒自发荧光更低流式细胞仪精度：分析白细胞要求精度在600MESF以内，分析其它细胞或颗粒需要更高精度：200MESF以内流式细胞仪原理和一般用法专家讲座第10页Partec-ExcellenceinFlowCytometry超出41年研发经验常见荧光染料列表染料名称激发波长（nm）最大发射波长(nm)应用抗体FITC488530普通应用PEARDI488/565575FITC及2重染色ECD488/565613多重免疫染色用PC5/PE-Cy5488/565/650670多重免疫染色用PC7/PE-Cy7488/565767多重免疫染色用Cy5633670多重免疫染色用APC650660多重免疫染色用DNA/RNAPl488/5366171色染色体、DNA细胞周期、除去死细胞YOYO-l491509DNA细胞周期、除去死细胞CPO488530/670DNA(530)/RNA(670)、网织红细胞检测7-AAD546647G-C特异性、DNA细胞周期、除去死细胞SYTO16488518活细胞染色SYTOXGreen504523DNA细胞周期TO-PRO-3642661除去死细胞DAPI360DNA细胞周期流式细胞仪原理和一般用法专家讲座第11页Partec-ExcellenceinFlowCytometry超出41年研发经验常见荧光染料列表钙Fluo-3AAMA506525细胞内钙离子检测FuraRedAAMA473670细胞内钙离子检测pHBCECF(AM)488535细胞内pHSNARF-l(AM)488587A635细胞内pH(pH6-9)酶Fluorecein495519与酶基质结合后使用、检测活细胞内酶活性Rhodamine-110497520与酶基质结合后使用、检测活细胞内酶活性其它CMFDA488530活细胞内水平检测、MDRRhodamine-123488530活细胞内线粒体、MDREGFP488510基因表示DiOC2(3)488530细胞膜电位DiBAC4(3)493516细胞膜电位DCFH-DA488530细胞内活性酶DHR505534细胞内活性酶FDA488530活细胞染色CalceinAM496517活细胞染色、乙啡叮同型二聚体-1双色检测判断细胞死活流式细胞仪原理和一般用法专家讲座第12页Partec-ExcellenceinFlowCytometry超出41年研发经验惯用荧光染料种类488nm蓝色激光激发：FITC(异硫氰酸荧光素）：绿色530nmPE（藻红蛋白）：橙黄色575nmPE-Cy5（PE衍生物）：红色665nmPerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白）：红色 675nmPI(碘化丙啶）：橙红色620nm 637nm红色激光激发：APC(别藻兰蛋白）：红色665nmAPC-Cy5(别藻兰蛋白衍生物）：深红色710nm365nm紫外光激发：DAPI（4，6-咪基-2联苯吲哚）：蓝色455nm532nm绿色激光激发：PE（藻红蛋白）：橙黄色575nmPE-Dy647（PE衍生物）：红色647nmPE-Cy5（PE衍生物）：红色665nm流式细胞仪原理和一般用法专家讲座第13页Partec-ExcellenceinFlowCytometry超出41年研发经验流式细胞仪原理概述流式细胞仪（FlowCytometer简称FCM）是一个自动分析细胞高端技术设备，其原理是悬浮在液体中细胞一个个地依次经过测量区，当每个细胞经过测量区并被激发光照射时产生光信号，然后被光电倍增管（PMT）转化成电信号，这些信号能够代表荧光、普通光散射、光吸收或细胞阻抗等。这些信号能够被测量、存贮、显示，于是细胞一系列主要物理特征和生化特征就被快速地、大量地测定。上述特征能够是细胞大小、活性，核酸数量、酶、抗原等等。仪器还能够依据所要求参量把指定细胞亚群从整个群体中分选出来。废液检测器&计数器样品流式细胞仪原理和一般用法专家讲座第14页Partec-ExcellenceinFlowCytometry超出41年研发经验流式细胞仪原理工作原理待测细胞被制备成单个细胞悬液，经特异性荧光染料染色后放入样品管中，在气体压力下进入流动室。流动室内充满鞘液，在鞘液约束下，细胞排成单列由流动室喷嘴喷出，成为细胞液柱。液柱与入射激光束垂直相交，相交点称为测量区。经过测量区细胞被激发产生荧光。在与入射光束和液柱垂直方向放置光学系统（透镜、光阑，滤片和检测器等）用以搜集荧光信号。光电倍增管将搜集光信号转化为电信号再传输至计算机，计算机经过对应软件将电信号模拟成图像。流动室(FlowCuvette或FlowCell)是仪器关键部件，被测样品在此与激光相交。流动室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央开一个孔径为350×250um长方形孔，供细胞单个流过，检测区在该孔中心，这种流动室光学特征良好，流速较慢,因而细胞受照时间长，可搜集细胞信号光通量大，配上广角搜集透镜，可取得很高检测灵敏度和测量精度。流动室内充满了鞘液,鞘液作用是将样品流环包。鞘液流是一个稳定流动液体，操作人员无法随意改变其流动速度,样品流在鞘流环包下形成流体动力学聚焦，使样品流不会脱离液流轴线方向，结合样品喷嘴特殊结构，从而确保每个细胞经过激光照射区时间相等，从而得到准确细胞信息（散射光和荧光）。流式细胞仪原理和一般用法专家讲座第15页超出41年研发经验激光，如：488nmFL2PESSCFSC液路电子元件部分计算机FL3PerCP,Cy5

FL1FITC光学接收器流式细胞仪原理和一般用法专家讲座第16页Partec-ExcellenceinFlowCytometry超出41年研发经验流式细胞仪结构流动室及液流驱动系统激光光源及光束形成系统光学系统（滤光片组）信号检测与存放系统显示、分析系统流式细胞仪原理和一般用法专家讲座第17页Partec-ExcellenceinFlowCytometry超出41年研发经验激光提供单波长、高强度及稳定性高光照，是细胞微弱荧光快速分析理想光源，这是因为因为细胞快速流动，每个细胞经过光照区时间仅为１微秒左右，每个细胞所携带荧光物质被激发出荧光信号强弱，与被照射时间和激发光强度相关，所以要求细胞必须抵达足够光照强度。激光光束在抵达流动室前，先经过透镜，将其聚焦，形成几何尺寸约即短轴稍大于细胞直径光斑。这种椭园形光斑激光能量分布属正态分布;为确保样品中细胞是一个一个分别受到光照而且受照强度十分一致,须将样本流与激光束正交且相交于激光能量分布峰值处,台式机FCM光路调整对用户是封闭，即安装时由工程师调试完成后,无需用户作任何调整,所以用户操作十分方便。

流式细胞仪原理和一般用法专家讲座第18页Partec-ExcellenceinFlowCytometry超出41年研发经验光学系统流式细胞仪光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成，它们分别将不一样波长荧光信号送入到不一样电子探测器。在流式细胞仪光学系统中主要光学原件是滤光片，主要分为三类：长通滤片LP短通滤片SP带通滤片BP流式细胞仪原理和一般用法专家讲座第19页Partec-ExcellenceinFlowCytometry超出41年研发经验长通滤片长通滤片使特定波长以上光经过，特定波长以下不经过。如LP500滤片，将允许500nm以上光经过，而500nm以下光吸收或返回。流式细胞仪原理和一般用法专家讲座第20页Partec-ExcellenceinFlowCytometry超出41年研发经验短通滤片与长通滤片相反，特定波长以下光经过，特定波长以上光吸收或返回。流式细胞仪原理和一般用法专家讲座第21页Partec-ExcellenceinFlowCytometry超出41年研发经验带通滤片带通滤片可允许相当窄一波长范围内光经过，普通滤片上有两个数，一个为允许经过波长中心值，另一为允许经过光波段范围。如BP500/50表示其允许经过波长范围为475nm~525nm。流式细胞仪原理和一般用法专家讲座第22页Partec-ExcellenceinFlowCytometry超出41年研发经验信号检测与分析当细胞携带荧光素标识物，经过激光照射区时，受激光激发，产生代表细胞内不一样物质、不一样波长荧光信号，这些信号以细胞为中心，向空间360度立体角发射，产生散射光和荧光信号,下列图是以激发光光源波长488nm为例示意图：流式细胞仪原理和一般用法专家讲座第23页Partec-ExcellenceinFlowCytometry超出41年研发经验1.散射光信号：散射光分为前向角散射(FSC，ForwardScatter)和侧向角散射(SSC，SideScatter)，散射光不依赖任何细胞样品制备技术(如染色)，所以被称为细胞物理参数（或称固有参数）。(1)前向角散射：代表细胞体积大小，前向角散射与被测细胞大小相关，确切说与细胞直径平方亲密相关，通常在FCM应用中，选取FSC作阈值，来排除样品中各种碎片及鞘液中小颗粒，以防止对被测细胞干扰。(2)侧向角散射：代表细胞内容物多少（或称为密度），侧向角散射是指与激光束正交900方向散射光信号，侧向散射光对细胞膜、胞质、核膜折射率更为敏感，可提供相关细胞内精细结构和颗粒性质信息。2.荧光信号：当激光光束与细胞正交时，普通会产生两种荧光信号。一个是细胞本身在激光照射下发出微弱荧光信号，称为细胞自发荧光；另一个是经过特异荧光素标识细胞后，受激发照射得到荧光信号，经过对这类荧光信号检测和定量分析就能了解所研究细胞参数存在与定量。流式细胞仪原理和一般用法专家讲座第24页Partec-ExcellenceinFlowCytometry超出41年研发经验光电倍增管怎样产生电压脉冲信号电压脉冲激光激光激光ttt电压脉冲电压脉冲1.2.3.流式细胞仪原理和一般用法专家讲座第25页Partec-ExcellenceinFlowCytometry超出41年研发经验高度、宽度和面积时间

(µs)电压脉冲面积(A)脉冲高度

(H)脉冲宽度(W)400流式细胞仪原理和一般用法专家讲座第26页Partec-ExcellenceinFlowCytometry超出41年研发经验脉冲信号宽度和面积通惯用来区分双粘体细胞流式细胞仪原理和一般用法专家讲座第27页Partec-ExcellenceinFlowCytometry超出41年研发经验阈值阈值用来定义能够被光电倍增管识别最小或最大信号强度，低于阈值下限或高于阈值上限信号将不被光电倍增管识别，也不在图形中显示。流式细胞仪原理和一般用法专家讲座第28页Partec-ExcellenceinFlowCytometry超出41年研发经验荧光信号线性测量和对数测量线性放大：

即放大器输出与输入是线性关系，细胞DNA含量、RNA含量、总蛋白质含量等测量普通选取线性放大测量。对数放大：

即放大器输出成10倍关系，假如原来输出是1，当输入增大到原来10倍时，输出为2；当输入增大到原来100倍时输出是3等等。在免疫学样品中，细胞膜表面抗原分布有时要差几十倍甚至几万倍。假如用线性放大将无法在一张图上清楚地将细胞阳性群、阴性群同时显示出来。。流式细胞仪原理和一般用法专家讲座第29页Partec-ExcellenceinFlowCytometry超出41年研发经验流式细胞仪数据格式FCS：帧校验序列（FCS）字段，通常为16位（2个字节长），也能够为4个字节。软件执行中能够经过预先协议采取32位FCS来提升差错检测效果。FCS1.0研发于1984年FCS2.0研发于1990年，兼容1.0格式FCS3.0研发于1997年，兼容前二者

支持UNICODE文本处理单个数据文件大于100MB流式细胞仪原理和一般用法专家讲座第30页Partec-ExcellenceinFlowCytometry超出41年研发经验FCS文件结构存放于3或4个片段中文件头信息：用于判别FCS文件，包含判别文本文件片段数值。文本信息：描述样品信息和状态一些数值。数据：在文本信息中存放数值特殊格式。流式细胞仪原理和一般用法专家讲座第31页Partec-ExcellenceinFlowCytometry超出41年研发经验文件头信息：文本信息：流式细胞仪原理和一般用法专家讲座第32页Partec-ExcellenceinFlowCytometry超出41年研发经验参数FSC/SSC/荧光：第一个细胞第二个细胞最终一个细胞流式细胞仪原理和一般用法专家讲座第33页Partec-ExcellenceinFlowCytometry超出41年研发经验数据显示种类直方图散点图三维图流式细胞仪原理和一般用法专家讲座第34页Partec-ExcellenceinFlowCytometry超出41年研发经验直方图（用于单参数分析）横坐标，X轴表示光强度，强度高光信号靠右侧显示。纵坐标，Y轴表示数量累计，相同强度光信号在同一横坐标点（通道）内向Y轴方向累计。FITCFITCFITCFITCFITCFITCFITCFITCFL1-FITCFITCFITC流式细胞仪原理和一般用法专家讲座第35页Partec-ExcellenceinFlowCytometry超出41年研发经验散点图（用于双参数分析）横坐标，X轴表示光强度，强度高光信号靠右侧显示。纵坐标，Y轴表示光强度，强度高光信号靠上侧显示。与X轴/Y轴平面900垂直相交，Z轴表示数量累计，相同强度光信号在同一横/纵坐标点（X/Y轴通道）内向Z轴方向累计。流式细胞仪原理和一般用法专家讲座第36页Partec-ExcellenceinFlowCytometry超出41年研发经验什么是Region？用户在显示图形中限定一个区域或范围作为靶区域或范围叫做Region。在同一张图中能够设置多个Region。

使感兴趣簇独立。对Region使用颜色可更加好地描述该范围或区域。流式细胞仪原理和一般用法专家讲座第37页Partec-ExcellenceinFlowCytometry超出41年研发经验什么是Gate？1.使用布尔数学体系操作方法（逻辑学）定义一个或将多个Region进行联合叫做Gate。2.被定义子集数据将被显示。3.被选定子集将被计算机计算数据和显示状态。4.解除噪音信号并能够最终被存放在硬盘上。流式细胞仪原理和一般用法专家讲座第38页Partec-ExcellenceinFlowCytometry超出41年研发经验什么是Mean？1.算术定义平均值。2.几何定义平均值。假设样品为V，数量为n，则：算术定义平均值=（V1+V2+V3…+Vn)/n几何定义平均值=流式细胞仪原理和一般用法专家讲座第39页Partec-ExcellenceinFlowCytometry超出41年研发经验怎样取平均值？线性放大对数放大对数放大算术平均值算术平均值几何平均值（4*64+6*128+2*192+1*256）/13（4*10+6*100+2*1000+1*10000）/13=128=972.3=100流式细胞仪原理和一般用法专家讲座第40页Partec-ExcellenceinFlowCytometry超出41年研发经验光谱交叉重合与赔偿？当一个激光束激发两种荧光染料而发射出两种不一样波长荧光时，这两种发射光会出现光谱部分重合现象，从而造成检测准确性下降，必须使用适当滤片或进行电子赔偿来尽可能降低光重合对试验影响。

FL-1PMTFL-2PMTFL-1-%FL-2FL-2-%FL-1流式细胞仪原理和一般用法专家讲座第41页Partec-ExcellenceinFlowCytometry超出41年研发经验未做赔偿R4/R1=41%R3/R1=24.21%R2/R1=34.3%做赔偿后R4/R1=41.04%R3/R1=24.75%R2/R1=34.22%赔偿，我们通常按照细胞聚集区中心点来计算，但实际原理是按细胞团位置来定，也就是纯粹按照计算得出，比如上图R4细胞团，它在X轴上位置是0.3到1之间，在Y轴位置是2到6之间，这团细胞平均值在FL1,FL2中分部坐标为0.68,3.9;所以斜率为0.68/3.9=17.43，所以FL1赔偿后平均值为FL1-17.43%FL2=0.68-17.43%*3.9=0.0023，它右侧区域应该在1-17.43%*3.9=0.32，左侧区域应该在0.3-17.43%*3.9=-3.79，因为是负数，就自动归为0.1了，假如是完全按照计算来做赔偿，图形将很大一部分跑出了双参数图，也就是说无法得到我们满意图形，但因为我们勾选了“RandomBias”，全部图形将重新被分配，就像上图Q1门中显示一样。，我们通常按照细胞聚集区中心点来计算，但实际原理是按细胞团平均值来计算。流式细胞仪原理和一般用法专家讲座第42页Partec-ExcellenceinFlowCytometry超出41年研发经验FL1-未染色FL2-未染色FL1-染色FL2-未染色FL1-FITCCD3赔偿后平均值=~2.0FL1-染色FL2-未染色流式细胞仪原理和一般用法专家讲座第43页Partec-ExcellenceinFlowCytometry超出41年研发经验流式细胞仪原理和一般用法专家讲座第44页Partec-ExcellenceinFlowCytometry超出41年研发经验上机检测样本染色及溶血过程处理完后应马上上机检测打开流式细胞仪(选择进行质控程序）打开应用软件并选择对应方案或新建方案加载或重新调整各参数上样检测流式细胞仪使用普通方法及技巧流式细胞仪原理和一般用法专家讲座第4