高效液相色谱分类及工作原理

高效液相色谱分类及工作原理演示文稿现在是1页\一共有51页\编辑于星期二高效液相色谱分类及工作原理现在是2页\一共有51页\编辑于星期二生物材料和生物体液是目前所知道撮复杂的化学物质的混合物，所含成分在一万种以上，其分子量从18到几百万，而且其中有意义的化学成分的含量又往往很低，因此，必须要有一种高分辨、高灵敏度的分离鉴定手段，气相色谱和高压液相色谱具有以上特点，它们可通过对生物样品和生物体液样品的有关成分的提取、分离、分析定量，进行对疾病的早期快速诊断的研究，病理病因的研究，以及药物在体内代谢的研究……等。现在是3页\一共有51页\编辑于星期二高压液相色谱对于挥发性低、热稳定性差、分子量大的高分子化合物以及离子型化合物的分离尤为有利。如氨基酸、多肽、蛋白质、生物碱、核酸、甾体、类脂、维生素、抗菌素等均可进行分离分析定量。现在是4页\一共有51页\编辑于星期二第一节高效液相色谱法概述现在是5页\一共有51页\编辑于星期二现在是6页\一共有51页\编辑于星期二现在是7页\一共有51页\编辑于星期二现在是8页\一共有51页\编辑于星期二一、理论基础：速率理论A为涡流扩散项B/u分子扩散项Cu项即传质阻力项现在是9页\一共有51页\编辑于星期二二、HPLC技术采用高压输液泵，高效微粒固定相和高灵敏度检测器。三、HPLC特点高压、高速、高效、高灵敏度、样品回收方便。现在是10页\一共有51页\编辑于星期二㈠经典LC与HPLC比较

经典LCHPLC柱之内径1~5cm~0.4cm长度50~100cm15~50cm填充材料粒度150µm~200µm4µm~10µm使用压力1~10atm50~200atm分离时间0.5h~天~10min现在是11页\一共有51页\编辑于星期二㈡与气相色谱法比较，HPLC的优点分析对象广

气相色谱只限于分析气体和沸点较低的化合物；HPLC不受样品挥发性和热稳定性的限制，适用于高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质。原则上讲，几乎可以分析除永久气体外所有的有机和无机化合物。

现在是12页\一共有51页\编辑于星期二⒉流动相对分离起作用

气相色谱的流动相仅起运载作用，对组分不产生相互作用力；HPLC的流动相对组分产生相互作用力，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数。现在是13页\一共有51页\编辑于星期二⒊经常在室温条件下操作

气相色谱法一般在较高温度下进行缺点：仪器设备费用昂贵，操作严格。现在是14页\一共有51页\编辑于星期二第二节HPLC的主要类型一、液一液分配色谱法（LLPC）

在液-液色谱中,流动相和固定相都是液体,它能适用于各种样品类型的分离和分析，无论是极性的和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和非离子型的化合物。

现在是15页\一共有51页\编辑于星期二1．分离原理液液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，都是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。所不同的是液液色谱的分配是在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次进行，造成各组分的差速迁移，提高了分离效率，从而能分离各种复杂组分。现在是16页\一共有51页\编辑于星期二

2.固定相液液色谱的固定相由载体和固定液组成。常用的载体有下列几类：（1）全多孔型载体：由硅胶、硅藻土等材料制成，直径约100m的全多孔型颗粒。

这类固定相由于颗粒很细，孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析。现在是17页\一共有51页\编辑于星期二（2）表面多孔型载体（薄壳型微珠载体）：由直径为30~40m的实心玻璃球和厚度约为1~2m的多孔性外层所组成。目前，这种载体粒度为5~10m。

这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达平衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，最大允许量受限制。现在是18页\一共有51页\编辑于星期二⑶化学键合固定相：它是将各种不同有机基团通过化学反应键合到载体表面的一种方法。它代替了固定液的机械涂渍，因此它的产生对液相色谱法迅速发展起着重大作用，可以认为它的出现是液相色谱法的一个重大突破。它是目前应用最广泛的一种固定相。据统计，约有3/4以上的分离问题是在化学键合固定相上进行的。现在是19页\一共有51页\编辑于星期二3．流动相

根据所使用的流动相和固定相的极性程度，将其分为正相分配色谱和反相分配色谱。正相分配色谱：流动相的极性小于固定相的极性，它适用于极性化合物的分离。其流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出。反相分配色谱：流动相的极性大于固定相的极性，它适用于非极性化合物的分离，其流出顺序与正相色谱恰好相反现在是20页\一共有51页\编辑于星期二二、液一固吸附色谱法(LSAC)

液一固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相，吸附剂通常是些多孔的固体颗粒物质，在它们的表面存在吸附中心。液固色谱实质是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的。现在是21页\一共有51页\编辑于星期二1．分离原理当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的活性中心就要吸附流动相分子。同时，当试样分子（X）被流动相带入柱内，只要它们在固定相有一定程度的保留就要取代数目相当的已被吸附的流动相溶剂分用）于是，在固定相表面发生竞争吸附:

X+nSad=Xad+nS现在是22页\一共有51页\编辑于星期二达平衡时,有其中Kad为吸附平衡常数，值大表示组分在吸附剂上保留强，难于洗脱。Kad值小,则保留值弱，易于洗脱。试样中各组分据此得以分离。Kad值可通过吸附等温线数据求出。现在是23页\一共有51页\编辑于星期二2．固定相液－固吸附色谱所用固定相多是一些吸附活性强弱不等的吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酸胶等。由于硅胶的优点较多，如线性容量较高，机械性能好，不溶胀，与大多数试样不发生化学反应等，因此，以硅胶用得最多。目前最广泛使用的还是5～10m的全多孔型微粒填料。现在是24页\一共有51页\编辑于星期二3.流动相一般把吸附色谱中流动相称作洗脱剂。在吸附色谱中对极性大的试样往往采用极性强的洗脱剂；对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。现在是25页\一共有51页\编辑于星期二三、离子交换色谱法（IEC）此法是利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法。凡在溶液中能够电离的物质，通常都可用离子交换色谱法进行分离。它不仅适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。因此，应用范围较广。现在是26页\一共有51页\编辑于星期二1．离子交换原理离子交换色谱法是利用不同待测离子对固定相亲和力的差别来实现分离的。其固定相采用离子交换树脂，树脂上分布有固定的带电荷基团和可游离的平衡离子。当待分析物质电离后产生的离子可与树脂上可游离的平衡离子进行可逆交换，其交换反应通式如下：现在是27页\一共有51页\编辑于星期二阳离子交换：阴离子交换：一般形式：R一A＋B＝R－B＋A现在是28页\一共有51页\编辑于星期二达平衡时，以浓度表示的平衡常数（离子交换反应的选择系数）：式中[A]r，[B]r分别代表树脂相中洗脱剂离子（A）和试样离子（B）的浓度，[A]、[B]则代表它们在溶液中的浓度。KB/A越大，说明B离子交换能力越大，越易保留而难于洗脱。一般说来，B离子电荷越大，水合离子半径越小，KB/A值就越大。现在是29页\一共有51页\编辑于星期二2.固定相（l）多孔型离子交换树脂它主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交联聚合物，直径约为5～20μm，有微孔型和大孔型之分。（2）薄膜型离子交换树脂

它是在直径约对30μm的固体惰性核上，凝聚1～2μm厚的树脂层。（3）表面多孔型离子交换树脂它是在固体情性核上，覆盖一层微球硅胶，再在上面涂一层很薄的离子交换树脂。现在是30页\一共有51页\编辑于星期二（4）离子交换键合固定相它是用化学反应将离子交换基团键合到惰性载体表面。它也分为两种类型。一种是键合薄壳型，其载体是薄壳玻珠。另一种是键合微粒载体型，它的载体是多孔微粒硅胶。后者是一种优良的离子交换固定相，它的优点是机械性能稳定，可使用小粒度固定相和高柱压来实现快速分离。现在是31页\一共有51页\编辑于星期二3.流动相

离子交换色谱法所用流动相大都是一定pH和盐浓度（或离子强度）的缓冲溶液。通过改变流动相中盐离子的种类、浓度和pH值可控制k值，改变选择性。

有时也使用有机溶剂如甲醇或乙醇同水缓冲溶液混合使用，以提高特殊的选择性，并改善样品的溶解度。现在是32页\一共有51页\编辑于星期二盐离子的浓度影响：如果增加盐离子的浓度，则可降低样品离子的竞争吸附能力，从而降低其在固定相上的保留值。现在是33页\一共有51页\编辑于星期二

要视不同情况而定。例如，分离有机酸和有机碱时，这些酸碱的离解程度可通过改变流动相的pH值来控制。增大pH值会使酸的电离度增加，使碱的电离度减少；降低PH值，其结果相反。但无论属于哪种情况，只要电离度增大，就会使样品的保留增大。pH值的影响：现在是34页\一共有51页\编辑于星期二四、离子对色谱法（IPC）离子对色谱法是分离分析强极性有机酸和有机碱的极好方法。离子对色谱法是将一种（或数种）与溶质离子电荷相反的离子（称对离子或反离子）加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成离子对，从而控制溶质离子保留行为的一种色谱法。现在是35页\一共有51页\编辑于星期二由于离子对化合物A-B+具有疏水性，因而被非极性固定相（有机相）提取。组分离子的性质不同，它与反离子形成离子对的能力大小不同以及形成的离子对流水性质不同，导致各组分离子在固定相中滞留时间不同，因而出峰先后不同。这就是离子对色谱法分离的基本原理。现在是36页\一共有51页\编辑于星期二流动相：加有平衡离子（反离子）的极性溶液通过改变流动相的pH、平衡离子的浓度和种类可改变分离的选择性。

固定相：非极性的疏水键合相现在是37页\一共有51页\编辑于星期二五、离子色谱法（IC）抑制型：抑制柱型、连续抑制型分离柱中离子交换树脂的交换容量通常在0.01～0.05毫摩尔/克干树脂非抑制型:当进一步降低分离柱中树脂的交换容量(0.007～0.07毫摩尔/克干树脂),使用低浓度、低电离度的有机弱酸及弱酸盐作淋洗液，如苯甲酸、苯甲酸盐等。检测器可直接与分离柱相连，不需抑制柱。⒈离子色谱装置类型现在是38页\一共有51页\编辑于星期二

现在是39页\一共有51页\编辑于星期二⒉离子色谱连续抑制装置图：现在是40页\一共有51页\编辑于星期二通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相，从而用电导检测器可直接检测各种离子的含量。若样品为阳离子，用无机酸作流动相，抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换剂。当试样经阳离子交换剂的分离往后，随流动相进入抑制柱，在抑制柱中发生两个重要反应：现在是41页\一共有51页\编辑于星期二R+－OH＋H+Cl--→R+－Cl十H2OR+一OH-＋M+Cl--→M+OH－＋R+－Cl-由反应可见：经抑制柱后，一方面将大量酸转变为电导很小的水，消除了流动相本底电导的影响。同时，又将样品阳离子M+转变成相应的碱，由于OH-离子的浓度为Cl-离子的2．6倍，提高了所测阳离子电导的检测灵敏度。对于阴离子样品也有相似的作用机理。现在是42页\一共有51页\编辑于星期二⒊离子色谱的应用：阴离子分析:双柱：薄壳型阴离子交换树脂分离柱(3×250mm),流动相：0.003mol·L-1NaHCO3/0.0024mol·L-1Na2CO3，流量138mL/hr。七种阴离子在20分钟内基本上得到完全分离，各组分含量在3～50ppm。现在是43页\一共有51页\编辑于星期二

现在是44页\一共有51页\编辑于星期二六、空间排阻色谱法（SEC）主要用于较大分子的分离。与其他液相色谱方法原理不同，它不具有吸附、分配和离子交换作用机理，而是基于试样分子的尺寸和形状不同来实现分离的。

现在是45页\一共有51页\编辑于星期二1.固定相排阻色谱固定相种类很多，一般可分为软性、半刚性和刚性凝胶三类。

所谓凝胶，指含有大量液体（一般是水）的柔软而富于弹性的物质，它是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体。现在是46页\一共有51页\编辑于星期二（1）软性凝胶如