肿瘤分子检测与质量控制

肿瘤分子检测与质量控制第1页/共35页医学发展历程的启示经验医学循证医学精准医学诊断靠治疗后期经验积累。诊断治疗以人群、科学研究证据指导临床实践。诊断治疗以个体为基础，更加提前、具体与精确。分子时代第2页/共35页第3页/共35页腺癌鳞癌21%25%36%7.8%3.3%2.6%2.2%0.8%0.7%0.7%0.1%肺腺癌：EGFR\KRAS\BRAF\ALK-ROS1\RET等检测已是共识；肺鳞癌发生模式不同，检测靶标以扩增为主，同时EGFR、ALK\ROS1某些病例也有必要检测。第4页/共35页我们可以用的分子生物学手段：实时荧光PCR方法（扩增阻碍突变系统法（AmplificationRefractoryMutationSystem，ARMS）、PCR-高分辨溶点曲线分析（HRM）、数字PCR等）PCR-杂交法（膜上、芯片[基因芯片]、乳胶颗粒[Luminex]）PCR-Sanger测序PCR-焦磷酸测序新一代高通量测序PCR-SSCP、RFLP、dHPLC等荧光原位杂交（FISH）直接杂交免疫组化第5页/共35页分子病理检测的主要方法基因突变(SNPs)拷贝数改变(CopyNumberVariation,CNV)基因重排（Gene

rearrangement)检测技术蛋白(质)表达(Proteinexpression)免疫组织化学（IHC）…基因表达(mRNA/RNA

expression）反转录+荧光定量PCR（RT-qPCR)…FISH…DNAsequencing，

ARMS…检测对象检测基因检测水平EGFR，KRAS，BRAF，BRCA,BCR-ABL，JAK2…EML4-ALK，ROS1，HER2，RET…BRCA1，TOP2A，TYMS…EGFR，EML4-ALK，HER2…第6页/共35页是RT-PCR平台上的特异扩增技术（易开展）共发表300多篇文献著名的大型临床研究

-如IPASS、INFORM等国际肺癌协会专家共识

中国基因突变检测专家共识

日本临床专家共识IPASSINFORM大型临床研究所采用ARMS技术

——被临床证明的肿瘤基因突变检测技术第7页/共35页DNA基因重排融合mRNA或5’/3’mRNA差异表达嵌合蛋白表达肺癌中ALK基因变异的表达调控FISH/CISHNGSRT-PCR5’/3’比较qRT-PCRRACE-PCR…IHC第8页/共35页荧光原位杂交技术（FISH）2个信号分离直径的要求，使实际应用中结果难以判断有5-11%出现假阳性信号分离1，2，3工作强度大，费时主观性强，受人为因素影响大横向纵向1.FISH技术是美国药物临床试验中所采用的检测方法。2.采用“分离”分析，基因倒位和ALK重排后，红色和绿色探针分开3.≥15%的样本细胞中呈现分开的红色和绿色信号表示阳性结果1第9页/共35页操作简单，时间短结果客观，易于判读，减少人为因素的影响除FFPE样本外，还适用其他类型样本组织1与EGFR、RET、ROS1等其他检测不冲突，共用相同组织切片和PCR扩增程序，节约有限资源和时间中国荧光PCR仪器普及率更高，更加适合国情NTCPCFusionSample实时逆转录法（RealTime-PCR）第10页/共35页CFDA批准的基因检测产品项目EGFRALKROS1ALK/ROS1IHC

√

FISH

√

RealTime-PCR√√√√基于RealTime-PCR方法检测驱动基因的分子诊断产品获得CFDA批准最多第11页/共35页2-3片FFPE样品同时将DNA和RNA分离出来同时获得EGFR、ALK和ROS1检测结果节约样本、节约时间、节约成本DNA/RNAEGFR突变型ALK阳性或ROS1阳性EGFR野生型ALK阴性ROS1阴性吉非替尼厄洛替尼埃克替尼阿法替尼克唑替尼色瑞替尼其他治疗方式DNA/RNA共分离剂盒EGFR/ALK+ROS12.5小时PCR4.5小时FFPE切片1-3片或活检小标本第12页/共35页2015NSCLC

NCCN指南对于NSCLC患者建议检测EGFR和ALK基因状态；对于ROS1/MET/RET/BRAF/HER2等崭露头角的靶基因也给予关注第13页/共35页1.室内质量控制2.室间质量评价分子病理实验室的质量控制第14页/共35页1.建立标准化的实验室2.具备资质且相对固定的人员3.性能稳定的试剂4.持续不断的学习和开展质控第15页/共35页《医疗机构临床基因扩增检验室管理办法》（卫办医政发[2010]194号）《医疗机构临床基因扩展检验实验室工作导则》（卫办医政发[2010]194号）第16页/共35页试剂准备区空气流向标本制备区空气流向扩增区空气流向产物分析区空气流向缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间工作走向第17页/共35页第18页/共35页第19页/共35页第20页/共35页FISH实验区第21页/共35页临床基因扩增实验室标准化操作文件（sop）1.写你所做2.做你所写3.实验室的精髓可操作性的sop文件第22页/共35页人员资质第23页/共35页理想的试剂试剂方法的性能验证及每批试剂的质检性能指标：

重复性（精密度）

准确性（定量：回收率、标准物质等；定性：方法学比较等）

线性范围（定量）

分析特异性

测定下限

抗干扰能力第24页/共35页

资质认证试剂质量试剂反应性能前后批号结果一致性测定下限批内变异（<10%)和批间变异（<15-25%)第25页/共35页你其实做了这些，但是你有记录么？1.日常维护2.定期保养3.维修记录实验室最忠实的员工-----仪器第26页/共35页全流程：标本接收-石蜡切片-核酸提纯-实时荧光定量PCR扩增-结果分析分析前：标本接收、制片、填写检测申请单分析中：核酸提取、扩增、产物分析、检测有效性判断分析后：结果分析、报告审核、结果解释标准：重复，可控，规范全流程室内质控第27页/共35页组织蜡块切片病理学评估核酸纯化实验/数据DNA模板质量更重要，建议对提取的DNA模板进行质量检测：

OD260/OD280=1.8±0.2，

OD260/OD230≥1.7全流程室内质控第28页/共35页检查设定参数平台期背景荧光阈值线设定阈值检查对照组及内外控曲线情况阳性质控品突变样本突变分析第29页/共35页第30页/共35页RNA制备逆转录选用CFDA认证的检测试剂认证的核酸抽提试剂病理小样本中性福尔马林组织保护液快速低温放置微量紫外分光光度计Q-PCREGFREML4-ALKK-rasB-rafPI3K好流程才有好结果FFPE-DNAFFPE-RNAFFPE-DNA/RNA血清/血浆游离DNA