核酸的理化性质专业知识专家讲座

1核酸物理化学性质

核酸的理化性质专业知识专家讲座第1页2核酸普通物理性质性状：

DNA为白色纤维状固体，而RNA为白色粉末。

溶解度：DNA和RNA均不溶于普通有机溶剂，微溶于水，但它们钠盐在水中溶解度较大。

分子大小：DNAMr106～1010或更大

RNAMr104～106或更大核酸的理化性质专业知识专家讲座第2页3第一节核酸水解(P502)磷酸酯键嘌呤糖苷键嘧啶糖苷键核酸水解：全部糖苷键、磷酸酯键能被酸、碱和酶水解。核酸的理化性质专业知识专家讲座第3页4

糖苷键和磷酸酯键都能被酸水解，但糖苷键更易被酸水解，嘌呤碱糖苷键比嘧啶碱更易被酸水解。一、酸水解

对酸敏感性：

糖苷键＞磷酸酯键

嘌呤糖苷键＞嘧啶糖苷键核酸的理化性质专业知识专家讲座第4页5pH2.8100℃、1hrDNA无嘌呤酸

pH1.6,37℃

对水透析(除去嘌呤碱)

对酸最不稳定是嘌呤与脱氧核糖之间糖苷键（嘌呤碱）

：

核酸的理化性质专业知识专家讲座第5页6嘧啶糖苷键(DNA或RNA)完全水解

甲酸(98~100%)加热密封(175℃2hr)

嘧啶糖苷键水解则需要较高温度：

(DNA)完全水解

三氟乙酸加热(155℃60min)(RNA)完全水解

三氟乙酸加热(155℃80min)嘧啶碱回收率高尿嘧啶碱回收低核酸的理化性质专业知识专家讲座第6页7RNA磷酸酯键对碱敏感、所以RNA易被碱水解，产生核苷酸。

在室温，0.3～1mol/LKOH，24h，就可将RNA完全水解，得到2′-或3′-核苷酸混合物。

DNA无2′-OH，所以对碱有一定抗性：

生理意义：

DNA更稳定，是遗传信息载体。

RNA是DNA信使，完成任务后快速降解。二、碱水解核酸的理化性质专业知识专家讲座第7页8（一）核酸酶分类④其它分类标准①按底物专一性分类：RNase（核糖核酸酶）DNase（脱氧核糖核酸酶）②按对底物作用方式分类：核酸内切酶核酸外切酶小球菌核酸酶：内、外切均可三、酶水解③按磷酸二酯键断裂方式分类：3′-OH与磷酸基之间断裂如蛇毒磷酸二酯酶5′-OH与磷酸基之间断裂如牛脾磷酸二酯酶核酸的理化性质专业知识专家讲座第8页9③按磷酸二酯键断裂方式分类：3′-OH与磷酸基之间断裂如蛇毒磷酸二酯酶5′-OH与磷酸基之间断裂如牛脾磷酸二酯酶P482

蛇毒磷酸二酯酶从核酸5’端逐一水解下5’核苷酸

牛脾磷酸二酯酶从核酸3’端逐一水解下3’核苷酸P503核酸的理化性质专业知识专家讲座第9页10

蛇毒磷酸二酯酶从核酸5’端逐一水解下5’核苷酸,称为核酸5’外切酶，水解3’-OH形成酯键。

牛脾磷酸二酯酶从核酸3’端逐一水解下3’核苷酸，称为核酸3’外切酶，水解5’-OH形成酯键。核酸的理化性质专业知识专家讲座第10页11（二）核糖核酸酶类(RNase)3.RNaseT2

产物：将tRNA完全水解为以3′-腺苷酸结尾寡核苷酸1.牛胰核糖核酸酶（RNaseⅠ）

最适pH：7.0-8.2

产物：3′-嘧啶核苷酸或以其为结尾寡核苷酸。是高度专一内切酶2.RNaseT1

耐热、耐酸产物：3′-鸟苷酸或以其为结尾寡核苷酸，专一性更高。RNase只作用于RNA核酸的理化性质专业知识专家讲座第11页12（三）脱氧核糖核酸酶类(DNase)3.链球菌脱氧核糖核酸酶类

是一个内切酶，作用于DNA，产物为5’磷酸为末端碎片，长度不一，最适PH为7，需镁离子参加。2.牛脾脱氧核糖核酸酶:DNaseⅡ

产物：以3′-磷酸为末端寡核苷酸1.牛胰脱氧核糖核酸酶:DNaseⅠ

切断双链或单链DNA，产物：以5′-磷酸为末端寡核苷酸Dase只作用于DNA核酸的理化性质专业知识专家讲座第12页134.限制性内切酶：

在细菌中发觉有这类酶，主要降解外源DNA，第一个发觉限制性内切酶是从大肠杆菌(E.coli.)中发觉(1968年)。限制性内切酶命名（以EcoRI

为例）：大肠杆菌属名第一字母种名头2个字母所用大肠杆菌菌株细菌中已分离这一类酶编号EcoRI核酸的理化性质专业知识专家讲座第13页14核酸的理化性质专业知识专家讲座第14页15四、N-糖苷酶类：各种非特异糖苷酶或对碱基特异N-糖苷酶，可水解糖苷键。核酸的理化性质专业知识专家讲座第15页16第二节核酸酸碱性质

核酸碱基、核苷、核苷酸均能发生解离，所以核酸也就具备了可解离酸碱性质。核酸的理化性质专业知识专家讲座第16页171.碱基解离因为嘧啶和嘌呤化合物杂环中N以及各取代基（-OH）具结合和释放质子能力，所以这些物质现有碱性解离又有酸性解离。各种碱基解离特点及其常数见书本P505核酸的理化性质专业知识专家讲座第17页182.核苷解离

戊糖存在增强了碱基酸性解离。核苷=碱基+

戊糖。核酸的理化性质专业知识专家讲座第18页193.核苷酸解离

因为磷酸基存在，使核苷酸具较强酸性磷酸基（含两个羟基）解离pK’10.7~1.6pK’25.9~6.5核酸的理化性质专业知识专家讲座第19页胞嘧啶核苷酸解离：核苷酸两性解离和等电点123核酸的理化性质专业知识专家讲座第20页21核苷酸解离曲线pK1=0.9第一磷酸基pK3=6.2第二磷酸基pK2=3.7含氮环腺嘌呤核苷酸pK1=0.7第一磷酸基pK3=6.1第二磷酸基pK2=3.7含氮环烯醇式羟基鸟嘌呤核苷酸pK1=0.8第一磷酸基pK3=6.3第二磷酸基pK2=4.3含氮环胞嘧啶核苷酸pK1=1.0第一磷酸基pK3=6.4第二磷酸基烯醇式羟基尿嘧啶核苷酸pH离子化程度核酸的理化性质专业知识专家讲座第21页22因为核苷酸含磷酸与碱基，为两性电解质，它们在不一样pH溶液中解离程度不一样，在一定条件下可形成兼性离子。pI=1/2(pk1′+pk2′)

pH<pI,

核苷酸带正电pH>pI,

核苷酸带负电在第一磷酸基和含N环解离曲线交叉处，带负电荷磷酸基与带正电荷含N环数目相等，此时pH即为核苷酸等电点：核酸的理化性质专业知识专家讲座第22页23小牛胸腺DNA滴定曲线pHⅠ：酸碱正向滴定；Ⅱ：酸碱反向滴定。4.核酸滴定曲线P506

天然DNA与变性DNA滴定曲线不一样，双链解开碱基即参加酸碱滴定。所以DNA酸碱滴定曲线对了解DNA酸碱变性有帮助。DNA酸碱变性使酸碱滴定曲线不可逆核酸的理化性质专业知识专家讲座第23页24第三节核酸紫外吸收P507核酸的理化性质专业知识专家讲座第24页25

嘌呤碱和嘧啶碱含有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240～290nm紫外波段有较强吸收峰，最大吸收在260nm附近。不一样核苷酸有不一样吸收特征，据此可对核酸进行定量和定性测定。

紫外吸收是试验室中最惯用定量测DNA或RNA方法。对待测核酸样品纯度也可用紫外分光光度法测定。>1.8纯DNA>2.0纯RNAA260可测含量A260A280核酸的理化性质专业知识专家讲座第25页26核酸的理化性质专业知识专家讲座第26页271.通常：A260=1

相当于50μg/ml双螺旋DNA或40μg/ml单链DNA(或RNA)或20μg/ml寡核苷酸。2.不纯核酸：可用琼脂糖凝胶电泳分离出区带后，经溴化乙锭染色在紫外灯下粗估其含量3.有时核酸溶液紫外吸收以摩尔磷吸光度来表示，molp≈mol

核苷酸。摩尔磷吸光系数吸光值每升中磷重量(g)比色杯内径ε(p)=30.98AWL核酸的理化性质专业知识专家讲座第27页28单链多核苷酸ε(p)比双螺旋结构多核苷酸ε(p)值高：天然DNAε(p)=～6600RNAε(p)=7700～7800ε(p)=30.98AWL核酸发生变性时，ε(p)升高，此现象称增色效应。变性后核酸复性后ε(p)又降低，称减色效应。测核酸ε(p)可判断DNA制剂是否变性或降解。核酸的理化性质专业知识专家讲座第28页29第四节核酸变性、复性和杂交核酸的理化性质专业知识专家讲座第29页30一、核酸变性

(denaturation)1.核酸变性概念：

核酸变性指核酸双螺旋区氢键断裂，变成单链，并不包括共价键断裂。

核酸降解：多核苷酸骨架上共价键(3′,5′-磷酸二酯键)

断裂。核酸的理化性质专业知识专家讲座第30页31一、核酸变性

(denaturation)2.核酸变性原因：温度升高：热变性酸碱度改变：酸碱变性变性剂使用：尿素：PAGE中惯用变性剂；甲醛：琼脂糖凝胶电泳惯用变性剂DNA测序核酸的理化性质专业知识专家讲座第31页322202402602800.10.20.30.4波长（nm）光吸收123★核酸变性后理化性质：260nm吸收值升高。粘度降低，浮力密度升高。二级结构改变，部分失活。天然DNA变性DNA核苷酸总吸收值123核酸的理化性质专业知识专家讲座第32页33双链DNA部分变性解链DNA完全变性后分离开单链DNA3.DNA变性核酸的理化性质专业知识专家讲座第33页34A260升高,粘度降低,浮力密度升高,比旋下降,酸碱滴定曲线改变性质：结构：DNA稀盐液双螺旋解体无规线团链内碱基配对80～100℃变性作用发生于一个很窄温度范围内。DNA变性特点－暴发式核酸的理化性质专业知识专家讲座第34页35Tm值

DNA双螺旋结构失去二分之一时对应温度称为DNA解链温度（Tm）。浓度50ug/mL时，双链DNA

A260=1.00;完全变性（单链）时，A260=1.37。当A260增加到最大增大值二分之一时，即1.185时，对应温度即为Tm

。DNATm普通在82～95℃之间。核酸的理化性质专业知识专家讲座第35页36①

DNA均一性。

均一性高，DNA变性温度范围越窄，据此可分析DNA均一性。如一些病毒DNA，人工合成polyd(A-T)，polyd(G-C)熔解过程发生于一个较小温度范围之内。影响Tm值原因核酸的理化性质专业知识专家讲座第36页37

②G-C含量与Tm值成正比。

测定Tm，可推知G-C含量:[(G-C)%]=（Tm-69.3）×2.44DNATm值与DNAG－C碱基含量之间关系核酸的理化性质专业知识专家讲座第37页38③

介质中离子强度

离子强度高，Tm高；介质离子强度低，Tm低。

所以，DNA制品不应该保留在很稀电解质溶液中，普通来说，在含盐缓冲液中保留DNA是比较稳定。核酸的理化性质专业知识专家讲座第38页39RNA变性特点：⑴螺旋与线团之间转变。⑵因只具局部双螺旋区，不如DNA显著，变性曲线不那么陡，Tm较低。(3)tRNA双螺旋相对较多，故Tm较高。4.RNA变性核酸的理化性质专业知识专家讲座第39页40二、核酸复性

(renaturation)

核酸复性定义：

变性DNA在适当条件下，两条彼此分开链又能够重新缔合成为双螺旋结构，这个过程称为核酸复性。核酸的理化性质专业知识专家讲座第40页41高于Tm值5℃

复性也称退火

（annealing）核酸复性后特点：理化性质:↓比旋光度↑粘度↑生物活性得到部分恢复核酸复性（退火）核酸的理化性质专业知识专家讲座第41页42DNA复性原因：

在一定条件下复性反应速度可用Cot1/2衡量：1.热变性DNA假如骤然降温，这时DNA不可能复性。不过当热变性DNA迟缓冷却时，DNA能够复性(退火);2.DNA片段越大，复性愈慢;3.DNA浓度越大，复性越快。Co:变性DNA复性时初始浓度。t时间(秒)。Cot1/2

：表示复性二分之一Cot值核酸的理化性质专业知识专家讲座第42页43核酸的理化性质专业知识专家讲座第43页44概念：将不一样起源DNA放在试管里，经热变性后，迟缓冷却使其复性。假如这些异源DNA分子之间在一些区域有相同序列，那么在复性时会形成杂交DNA分子。这种现象叫做核酸杂交。不一样DNA单链间，或者DNA单链与互补RNA链之间都可有杂交现象发生。三、核酸杂交

(hybridization)

核酸的理化性质专业知识专家讲座第44页45三、核酸杂交

(hybridization)

双链DNA能与单链DNA碱基互补RNA变性解链后两条单链DNADNA-RNA杂化双链核酸的理化性质专业知识专家讲座第45页46核酸的理化性质专业知识专家讲座第46页47DNA-DNA杂交双链分子变性复性不一样起源DNA分子核酸的理化性质专业知识专家讲座第47页48

核酸探针（nucleicacidprobe）:能特异性探测带某一特定序列DNA或RNA分子标识核酸分子。核酸的理化性质专业知识专家讲座第48页49核酸的理化性质专业知识专家讲座第49页50

基因克隆筛选、酶