真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座

基因与基因工程基因操作主要技术原理基因克隆酶学基础基因克隆载体基因分离与判定基因表示与调整已讲述内容真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第1页讲述内容提要

真核基因大肠杆菌表示体系大肠杆菌表示载体真核基因在大肠杆菌中表示影响真核基因表示效率原因真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第2页第一节真核基因大肠杆菌表示体系真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第3页1.大肠杆菌表示体系基因工程主要目标制备大量纯化蛋白质产物所以，要选择能高水平表示异源真核蛋白表示系统当前惯用表示系统细菌（大肠杆菌）、酵母、昆虫细胞、植物和哺乳动物细胞等真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第4页背景清楚，尤其是对其基因工程表示调控分子机理研究比较深入。安全，且有各种不一样菌株和质粒载体。已经有许多真核基因在大肠杆菌中实现高效表示。培养方便、操作简单、成本低廉，所以易于进行批量生产大肠杆菌表示系统优越性真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第5页真核基因与原核基因差异：编码基因不连续性，含有内含子序列，大肠杆菌不具备对pre-RNA进行加工剪接能力。转录信号不一样：真核基因转录mRNA不具备结合细菌核糖体所必须SD序列；细菌RNA聚合酶不能识别真核开启子。真核基因mRNA5’-端有帽子结构，3’-端有poly(A)尾巴，影响其稳定性及与细菌核糖体结合能力，从而妨碍正常转录和翻译。真核基因在大肠杆菌中表示存在许多障碍真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第6页处理方案将克隆真核基因插入到原核开启子下游。从真核细胞中分离完整加工mRNA，采取反转录合成cDNA，并连接到适当载体上，能够克服内含子问题。假如知道蛋白质氨基酸序列，且分子量不太大，能够用化学方法合成不含内含子序列寡聚核苷酸片断。对于细菌中能降解真核蛋白蛋白酶，能够经过突变方法消除。真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第7页许多真核基因蛋白质产物存在翻译后修饰过程：磷酸化、糖基化等，大肠杆菌中无此过程，所以，表示蛋白无法正确折叠，由此产生三级结构通常是不可溶，常形成包涵体，无活性。表示真核蛋白质被细菌蛋白酶识别并降解。真核基因在大肠杆菌中表示存在许多障碍真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第8页2.克隆基因正确表示基本条件最基本条件：能够进行正常转录和翻译转录：真核基因置于原核开启子下游

3’-末端含有转录终止子翻译：mRNA分子含有RBS（ribosomebindingsite）包含AUG或GUG和与16SrRNA3’-末端互补

SD（Shine-Dalgarno）序列。真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第9页另一个主要条件：编码蛋白质产物应能维持正常稳定性。表示蛋白被大肠杆菌蛋白酶降解。蛋白质三级结构形成速率与其稳定性相关。蛋白质三级结构正确形成需要分子伴侣参加。大肠杆菌不可能对全部外源蛋白都存在正确分子伴侣。真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第10页第二节大肠杆菌表示载体真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第11页PSDCDSTTAmprOriRBSStartcodonStopcodon大肠杆菌表示载体基本结构特征真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第12页1.表示载体基本成份开启子：影响外源基因表示水平使外源基因高水平表示必须具备条件：强开启子开启子展现一个低限基础转录水平：表示外源蛋白可能对寄主细胞不利。诱导型开启子：能经过简单方式使用廉价诱导物使外源基因取得表示，如IPTG、温度等。真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第13页转录终止子上游开启子会抑制下游开启子转录功效(开启子封堵作用)，所以需要在克隆基因编码区3’-末端接上一个有效转录终止子。转录终止子能增强mRNA分子稳定性，从而提升蛋白质产物水平。真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第14页翻译起始序列：决定mRNA翻译起始效率。未判定出其保守结构，只能采取一些方法降低mRNA5’-末端二级结构形成，增加RBS中A、T含量，碱基定点突变等。增强子：特殊序列元件，能显著增强外源基因表示效率。真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第15页翻译终止子：必须存在终止密码子。构建表示载体时通常装上全部三个终止密码子(UAA,UGA,UAG)，以阻止核糖体跳跃现象。大肠杆菌最偏爱密码子：UAA当为四联核苷酸UAAU时，终止效率深入增强。真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第16页2.惯用大肠杆菌表示载体lac开启子表示载体阻遏物iPOzayRNA聚合酶结合区阻遏物结合区核糖体结合区乳糖操纵子结构模型真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第17页IDNAZYAOPmRNA阻遏蛋白pol没有乳糖存在时阻遏基因真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第18页mRNA阻遏蛋白有乳糖存在时IDNAZYAOPpol开启转录mRNA乳糖半乳糖β-半乳糖苷酶真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第19页lac操纵子受lac阻遏物负调整。培养基中缺乏乳糖或其它诱导物时，lac阻遏物同操纵单元结合，关闭乳糖操纵子活动。培养基中加入乳糖或其它诱导物(IPTG)时，同阻遏物结合，使乳糖操纵子去阻遏。所以，我们能够经过加入IPTG诱导来实现外源基因表示。真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第20页lac操纵子控制区，包含核糖体结合区、RNA聚合酶结合区及阻遏物结合区都位于长203bpHaeIII片断上。203bpHaeIII片断含有lac开启子、操纵单元及β-半乳糖苷酶前8个密码子。能够将该片断插入到质粒中，构建含有lac开启子质粒表示载体。真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第21页这种多拷贝质粒中操纵单元能够把大肠杆菌中全部lac阻遏物都结合掉，使细菌染色体β-半乳糖苷酶基因解抑制。含有质粒载体（lac开启子、操纵单元）大肠杆菌能够合成β-半乳糖苷酶，所以菌落在加有X-gal(底物)琼脂平板上呈蓝色。这种显色反应可用来快速判定阳性克隆。真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第22页trp开启子表示载体真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第23页TrpTrp高时Trp低时mRNAOPtrpR调整区结构基因RNA聚合酶RNA聚合酶?色氨酸操纵子真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第24页色氨酸不是作为诱导物，而是作为辅阻遏物结合trp阻遏分子。被色氨酸激活trp阻遏分子同操纵单元结合后，就使得RNA聚合酶失去同trp开启子结合机会，从而关闭trp基因转录。所以，当色氨酸浓度低时，trp基因转录才能开始。真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第25页将trp操纵子插入到质粒载体中，能够构建含有trp开启子表示载体。这种载体转化大肠杆菌后，经3-吲哚丙烯酸诱导，可使外源基因取得高效表示。该表示载体优点：表示蛋白产量高于lac操纵子表示系统。真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第26页PL开启子表示载体真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第27页起源于λ噬菌体，是一个最广泛使用大肠杆菌表示载体开启子之一。受阻遏基因cI编码蛋白正调控。cI基因存在一个温度敏感突变等位基因，即cI857。cI857或存在于大肠杆菌染色体上，或存在于相容性质粒分子上。真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第28页cI阻遏蛋白在42℃时失活，所以大肠杆菌在42℃培养时，

PL开启子开启转录；而在28-30℃培养时，cI阻遏蛋白有活性，使PL开启子处于抑制状态，转录停顿。利用这一特征，我们只要简单地改变培养温度，就能够诱导或关闭PL开启子活性。将PL开启子克隆到质粒载体上，能够构建由PL开启子开启表示载体。真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第29页真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第30页BamHI,SmaI,EcoRI,XbaI,NcoI,SalIXhoI,SacI,HindIII真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第31页第三节真核基因在大肠杆菌中表示真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第32页1.外源蛋白在大肠杆菌中表示部位细胞质中表示：易形成包涵体包涵体：由不可溶性蛋白聚集折叠形成，是外源基因高效表示时常发生一个特殊生理现象。包涵体形成理化参数：对E.coli80种蛋白研究取得。

电荷平均数、形成转角氨基酸残基组分、半胱氨酸组分、脯氨酸组分、亲水性和氨基酸残基总数。真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第33页分析蛋白质氨基酸组分能够预测包涵体形成概率。每种氨基酸出现在各种二级结构中倾向或者频率不一样。比如：Glu(谷aa)主要出现在螺旋中

Asp(天冬aa)和Gly(甘aa)主要分布在转角中

Pro也常出现在转角中，但普通不会出现在螺旋中真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第34页真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第35页表示蛋白形成包涵体优缺点：优点：易于分离蛋白被保护而免受胞内酶降解蛋白质没有活性，不会对寄主细胞造成伤害缺点：极难恢复生物学活性蛋白质终产量低真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第36页处理方案：限制包涵体形成⑴外源基因与分子伴侣共表示分子伴侣：能够阻止聚合作用而使蛋白质正确折叠。⑵使用硫氧还蛋白缺点寄主菌株目标：维持有利氧化还原电位⑶低温诱导，降低蛋白质合成速率⑷与高可溶性多肽融合表示真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第37页周质中表示优点：周质中细胞蛋白少，有利于外源蛋白纯化。周质中氧化环境有利于蛋白质正确折叠。周质中蛋白质降解作用小。条件：需要信号肽引导，使表示蛋白由细胞内膜转运到周质。信号肽：有原核信号肽，也有真核信号肽。真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第38页蛋白转运过程相当复杂蛋白质跨膜过程还与细胞结构特征相关。即使存在信号肽，也不能确保蛋白正确转运到周质中。如：免疫球蛋白与T-细胞受体分子结构相同。免疫球蛋白能够在周质中表示。

T-细胞受体不能在周质中表示。真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第39页细胞外表示：易于分离纯化，但相当困难。原因：细菌细胞有两层膜，即内膜和外膜，表示蛋白需跨越两层膜屏障。处理方案：⑴利用大肠杆菌固有路径：将外源蛋白与

E.coli分泌型蛋白融合表示。

⑵增加E.coli细胞外膜渗漏性：信号肽序列、透化剂、与细菌素释放蛋白或具透化作用基因共表示。真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第40页2.融合蛋白表示融合基因概念：含有来自两个或两个以上不一样基因核苷酸序列新型基因。DNA体外重组构建融合基因：外源基因与开启子融合：编码产物不一定是融合蛋白。两个或以上不一样基因编码序列组成融合基因：编码产物为单一多肽序列，称为融合蛋白、杂种蛋白、嵌合蛋白。真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第41页融合蛋白质配偶体作用：阻止包涵体形成改进蛋白质折叠性能限制蛋白酶酶解简化蛋白质检测与纯化程序种类：GST、His6、MBP等真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第42页表示融合蛋白策略用融合载体表示融合蛋白质：在设计时注意外源基因与靶基因连接后仍保持正确读码框。BamHI,SmaI,EcoRI,XbaI,NcoI,SalIXhoI,SacI,HindIIIpGEX-KG5.0kbPtacBspMIBalIPstIAlwNIpBR2332oriMluIBstEIINarIEcoRVBssHIIStopCodonsIGSTAmpLacIGAATTCTAGAEcoRIXbaI真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第43页用融合载体组合表示融合蛋白质：在克隆外源基因时，不用考虑读码框问题。真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第44页用pBR322质粒载体表示融合蛋白质

pBR322质粒载体中含有唯一PstI位点用末端脱氧核糖核苷酸转移酶和dGTP或dCTP进行同聚物加尾。G、C配对，T4DNA连接酶连接后，总有一部分含有正确读码结构。GGGGGGGGGGGGGGGGCCCCCCCCCCCCCCCC真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第45页融合蛋白纯化：利用与融合蛋白中配偶体相对应配体作为吸附剂，制备亲和层析柱。经过配偶体与配体之间相互作用，过柱融合蛋白被滞留下来，其它蛋白则流出柱外。经过洗脱处理，可回收到纯化融合蛋白。真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第46页真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第47页融合蛋白切割：配偶体存在可能影响融合蛋白功效。方法：化学切割：如溴化氰特异切割甲硫氨酸残基，AUG不是起始密码子时编码，适合链内不含甲硫氨酸残基多肽切割。MetGST外源蛋白真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第48页

酶切割：如凝血因子Xa，在融合基因之间插入编码Xa识别序列，融合蛋白纯化后可用Xa切除大肠杆菌多肽，得到天然目标蛋白。Ile-Glu-Gly-ArgGST外源蛋白真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第49页3.外源蛋白在大肠杆菌中稳定性

影响原因：蛋白酶解作用：细菌细胞蛋白酶能选择性地酶解异常蛋白质，包含外源蛋白。

处理方案：外源蛋白在周质或胞外表示使用蛋白酶缺点菌株低温培养、与分子伴侣共表示

消除蛋白酶切割位点、目标蛋白疏水性修饰真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第50页结构决定因子：N-氨基酸性质及内部PEST序列N-端法则：N-端为精aa、赖aa、亮aa、苯丙aa、酪aa、色aa时，蛋白质稳定性差。N-端附近内部赖aa是遍在蛋白质受体，易受依赖于遍在蛋白质蛋白酶降解。PEST序列：指真核蛋白中富含脯aa、谷aa、丝aa、苏aa区段，易发生胞内降解，该序列磷酸化作用增加了与钙离子结合，从而促进依赖于钙离子蛋白酶降解。真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第51页表示部位：周质与胞外所含蛋白酶较少，在这些部位表示蛋白不易被降解。分子伴侣稳定作用：阻止聚合作用，促进蛋白质正确折叠。一个分子伴侣超量表示无法使蛋白正确折叠，不一样类型分子伴侣彼此协调参加蛋白质折叠。真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第52页第四节影响真核基因表示效率原因真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第53页影响原因：开启子强度、DNA转录起始序列密码子选择、mRNA二级结构转录终止、质粒拷贝数及稳定性寄主细胞生理特征等真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第54页1.5’-UTR对克隆基因表示效率影响开启子结构影响：开启子序列含有2种保守序列，即-35区(5’-TTGACA)和-10区(5’-TATAAT)。开启子序列与此越相同，其表示能力越强。-35区和-10区之间距离：也是影响克隆基因表示效率主要原因。距离越靠近17bp，开启子活性越强。对于一些开启子，-35区上游10-100bp序列：起上游激活物作用。真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第55页开启子与克隆基因之间距离影响：发生2-3nt长度改变，就能显著影响翻译效率。与质粒mRNA5’-端二级结构相关：SD序列或AUG密码子参加mRNA分子碱基配对会显著降低mRNA翻译效率。要取得良好表示，AUG密码子或SD序列必须处于易接触部位，以利于与核糖体结合起始翻译过程。mRNA5’-末端与SD序列距离也是影响翻译效率主要原因，距离小于15nt时，翻译效率会显著下降。真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第56页提升克隆基因表示效率方案：建立克隆库：使目标基因放置在与开启子不一样距离位置上，从重组体中筛选产量最高克隆。对于表示产物难以测定基因，可先将其N-端片断与汇报基因融合，再建立克隆库，经过汇报基因产物活性来筛选克隆基因有效表示重组菌落。最终将该质粒中汇报基因用克隆基因C-端片断替换，即得到高效表示克隆基因重组质粒。真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第57页质粒拷贝数影响：提升表示效率路径：增加mRNA数量。影响mRNA合成速率原因有两种，即开启子强度和基因拷贝数。提升基因拷贝数：将其克隆到高拷贝数质粒载体上。质粒不稳定性影响：发生质粒丢失保持抗生素选择压力将质粒分配功效区par克隆到质粒载体上2.质粒生物学特征对表示效率影响真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第58页

对无质粒细胞进行反选择P1λcIT1P2外源基因T2转化大肠杆菌菌株溶源性细菌质粒丢失重组细菌λcI缺点λphageλ阻遏物丧失细菌死亡溶菌真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座第59页3.mRNA转录物分子