生物化学检验 大四下课件 血浆脂蛋白

第八章血浆脂蛋白代谢紊乱的生物化学检验

概述血浆脂质总量为4.0～7.0g/L。包括：

1.甘油三酯(triacylglycerol/triglyceride，TG).2.总胆固醇(totalcholesterol，TC)

游离胆固醇(freecholesterol，FC)

胆固醇酯(cholesterolester，CE)3.磷脂(Phospholipid，PL)4.游离脂肪酸(freefattyacid，FFA)血脂

Lipid载脂蛋白

ApolipoproteinApo脂蛋白

LipoproteinLP概念脂类+载脂蛋白脂蛋白

血浆脂蛋白(lipoprotein,LP)是血浆脂类的主要存在形式与运输形式血浆脂蛋白（lipoprotein,LP）定义：脂类不溶或微溶于水，无论是内源性或外源性脂类均以溶解度较大的脂蛋白复合体形式在血液循环中运输。

Pro.ChEPLTGFACh脂蛋白结构脂蛋白结构及组成

Lipid(TG、PL、FC和CE）

+Apo疏水核心+亲水表层（TG+CE+PL疏水基）

（Apo+PL亲水基）

颗粒大小CM>VLDL>LDL>HDL

血浆脂蛋白的分类

1．电泳分类法

乳糜微粒(Chylomicron，CM)

β-脂蛋白(β-LP)前β-脂蛋白(preβ-LP)

α-脂蛋白(α-LP)依据血浆脂蛋白分子中蛋白质表面电荷多少的不同而分离。

通常可分成：

CM、pre-β-LP、β-LP、α-LP

2．密度分类法

密度最小的为乳糜微粒（CM）

极低密度脂蛋白(VLDL)

低密度脂蛋白(LDL)

高密度脂蛋白(HDL)

CMCM-VLDL

前-LDL-HDL

电泳超速离心血浆脂蛋白

正常人血浆脂蛋白的分类及主要成分

CMVLDLLDLHDL

密度

＜O.940.94—1.0061.006—1.0631.063—1.21蛋白质(％)1—26—1018—2245—55甘油三酯(％)85—9550—654—82—7胆固醇(％)游离型

1—34—86—83—5酯型

2—416—2245—5015—20磷脂(％)3—415—2018—2426—32载脂蛋白

载脂蛋白(Apolipoprotein，Apo)是指血浆脂蛋白中的蛋白质部分。载脂蛋白的合成场所、分布、功能及临床意义载脂蛋白合成场所分布功能临床意义Apo-A肝、肠HDLAⅠ激活LCATAⅡ抑制LCAT高α脂蛋白血症Apo-BB100肝B48肠LDLCM受体识别Ⅱ型高脂血症Apo-C肝VLDLCⅠ激活LCAT及LPLCⅡ激活LPLCⅢ抑帛LPLV型高脂血症Apo-E肝VLDL（主要）HDL受体识别HDL形成IV型高脂血症载脂蛋白的生理功能(1)结构功能(2)调节功能(3)识别功能

三、脂蛋白受体LDL受体VLDL受体清道夫受体（一）低密度脂蛋白受体由836个氨基酸残基组成，分子量约115kD，五个不同的区域构成受体亲和性:含ApoB100的脂蛋白（LDL；VLDL；β-VLDL）可与LDL受体以高亲和力结合。LDL受体途径（LDLreceptorpathway）若胞内游离胆固醇浓度升高，则：①抑制HMGCoA还原酶，以减少自身的胆固醇合成；②抑制LDL受体基因的表达，减少LDL受体的合成，从而减少LDL的摄取；③激活内质网ACAT，使游离胆固醇在胞质内酯化成胆固醇酯贮存，以供细胞的需要。（二）极低密度脂蛋白受体

结构与LDL受体类似。对VLDL、VLDL残粒有高亲和性结合，对LDL为显著的低亲和性。在肝内几乎未发现，广泛分布在代谢活跃的心肌，骨骼肌、脂肪组织等细胞.VLDL受体不受细胞内胆固醇负反馈抑制。可能与肥胖成因有关（三）清道夫受体

(scavengerreceptor，SR)

◆清道夫受体结构◆清道夫受体配体

oxLDL,LDL,HDL,VLDL;参与脂质代谢◆功能：*使巨噬细胞泡沫化，促进粥样斑块的形成；*清除血管过多脂质和病菌毒素。四、血浆脂蛋白的代谢

（一）血浆脂蛋白代谢密切相关的酶类参与脂质代谢的酶有：脂蛋白脂肪酶（lipoproteinlipase，LPL）肝脂酶（hepatictriglyceridelipase，HTGL）LCAT(lecithincholesterylacetyltransferase)CETP(cholesterolestertransferprotein)一、LPL(lipoproteinlipase,脂蛋白脂肪酶)

（一）来源

脂肪细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、乳腺细胞等合成。

化学本质：糖蛋白，60kD

（二）功能

1．（主要）水解CM、VLDL中的TG

TG甘油一酯+FFA

2．促进脂蛋白之间PL、Apo和Ch的转换

（三）活性的调节

ApoCⅡ为活化剂

无活性有活性

ApoCⅡ二、肝酯酶（hepaticlipase,或hepatictriglyceridelipase,HTGL,HL，肝甘油三酯脂肪酶）

(一)来源：肝实质细胞

糖蛋白，53kD

（二）活性调节

不需要ApoCⅡ作为活化剂

（三）功能

1．主要（水解）VLDL及其残粒、β-VLDL中的TG

2．主要作用于小颗粒脂蛋白

3.调节胆固醇从周围组织转运到肝，使VLDL转变为LDL三、LCAT(lecithin-cholesterolacyltransferase,卵磷脂-胆固醇酰基转移酶)

(一)来源与特性

由肝合成，在血液中发挥催化作用。糖蛋白，含416个氨基酸残基，63kD。

(二)功能

1.(主要)催化HDL中的FC→CE，CE进入HDL核心储存。

卵磷脂FC

溶血卵磷脂CE

2.参与Ch的逆向转运和组织中过量Ch的清除。四、胆固醇酯转移蛋白

(cholesterolestertransferprotein,CETP),亦称为脂质转运蛋白(LTP)

(一)来源与性质

由肝、小肠、肾上腺、脂肪组织和巨噬细胞等合成。疏水性蛋白质，74kD

(二)功能：促进脂蛋白之间脂类的交换，参与血浆胆固醇的逆向转运。

胆固醇的逆向转运：肝外→肝(1)肝外组织细胞的FC结合至HDL上

(2)在HDL中，FCCE

HDL核心(储存)

转移至VLDL、LDL上

(3)肝细胞通过相应受体摄取VLDL、LDL

上述作用是由CETP、LCAT和HDL等协同完成的

若缺乏CETP，则HDL中的CE不能运出，导致血浆HDL-c↑

CE血浆脂蛋白代谢

1．乳糜微粒(CM)

CM是运输外源性甘油三酯的主要形式，呈球形，直径在80-500nm。CM有强烈的光散射作用，餐后大量CM进入血液可使血浆产生混浊，称为乳糜血。CM可飘浮到血浆表面形成一“奶油”层。

2．极低密度脂蛋白(VLDL)

VLDL是血液中第二种富含甘油三酯的脂蛋白，密度为0.96-1.006，呈球形，核心部分为非极性脂类，表面为单层极化分子。VLDL主要在肝合成，是内源性甘油三酯的转运形式。3．低密度脂蛋白(LDL)

LDL密度为1.006--1.063，是运载胆固醇的主要脂蛋白。呈圆球形核心部位为非极性脂类，主要是胆固醇酯。LDL代谢LDL受体代谢途径

LDL↑∝AS、CHD4.高密度脂蛋白HDL

周围组织的FC

肝盘状HDL（FC）肝外细胞（清除胆固醇）

LCATCETP

球状HDL（CEApoE）

肝代谢（胆汁酸等）脂蛋白(α)Lp（α

）β－脂蛋白抗原成分结构类似LDL，含Apo（α

），但分子量大、颗粒较大，电泳较慢。与纤溶酶原有高度同源性是心脑血管病的独立危险因子，与糖尿病、肾病、炎症等密切相关

Apo(a)

三环式结构

分布：主要包含在血浆LP(a)中。LP(a)也是正常存在于血浆中的一种脂蛋白，但人群间浓度差异甚大，0~1000mg/L

来源：肝

不受性别、年龄、体重、适度锻炼和降胆固醇药物的影响。有待于大量的实验依据和临床观察不断地深入研究第六节脂蛋白代谢紊乱

血浆脂类及脂蛋白的水平受到多种基因及环境的影响，脂质代谢紊乱导致脂类或脂蛋白浓度异常，临床上以脂蛋白代谢紊乱、代谢综合征和动脉粥样硬化最常见由某种原因导致的脂蛋白代谢紊乱，其基本表现为血浆脂蛋白水平异常改变。

主要为高脂蛋白血症（Hyperlipoproteinemia），也称为为“高脂血症”（Hyperlipidemia）。

以高脂血症最常见。

血浆脂蛋白异常代谢高脂血症、低脂血症低HDL血症、高HDL血症

原发性

继发性P125

分型的生化检验依据为：

(1)血清(血浆)外观：在4℃冰箱放置12h后的血清外观。透明(清亮)?混浊？有无奶油样层？

(2)血脂浓度：血清TG、TC含量

(3)血清LP电泳图谱：某种(些)LP含量(%)是否升高(相应区带是否深染、加宽?)一、原发性高脂蛋白血症（primaryhyperlipoproteinemia）

正常情况：

血清外观清亮、透明、均匀

TG0.56~1.70mmol/L(50~150mg/dl)

TC3.10~5.70mmol/L(120~220mg/dl)

血清LP电泳图谱正常

α—LP0.23~0.52

前β—LP0~0.30

β—LP0.35~0.60(供参考)

CM0

空腹血脂一、原发性脂蛋白代谢紊乱1976年Fredrickson等将其以表现型为基础分为六型，分别考虑了血清4℃过夜后的外观、血脂检测指标以及血清脂蛋白电泳等。此种分类方法每种分型都没有对应特定一种疾病，而是将血脂水平表现相似的疾病归为一类，只作为了描述脂蛋白异常的一种方法。随着研究的深入，尤其是遗传和分子诊断技术的发展，运用分子诊断技术对载脂蛋白进行基因分型，辅助临床对疾病的诊治。

原发性高脂蛋白血症分型及特征

分型Lp血脂Apo

外观病因

Ⅰ型

CMTC-TGB48A,C上：奶油下：透明

LPL缺陷CⅡ缺乏

Ⅱa型LDLTCB100透明-LDL受体缺陷Ⅱb型LDLVLDLTCTGBCⅡCⅢ混浊不明Ⅲ型(宽β病)IDLTCTGCⅡCⅢE混浊ApoE异常Ⅳ型VLDLTC-TGCⅡCⅢ混浊不明Ⅴ型CMVLDLTGTGCⅡCⅢE奶油混浊LPL缺陷,使CMVLDL处理↓血清外观分析血清清澈（TG正常）测定TCTC正常：正常人TC：Ⅱa型混浊（TG）4°C过度上层有“奶油”层（CM）均匀混浊（VLDL）下层清澈（VLDL）I型下层混浊（VLDL）V型TC：Ⅱb型、ⅢTC正常：Ⅳ型简易分型：高TC血症高TG血症高TC合并高TG混合型高脂血症低HDL血症第三节

脂蛋白代谢紊乱的生物化学检验一、血浆脂质测定二、血浆脂蛋白测定三、血浆载脂蛋白测定四、血浆脂代谢相关酶的测定五、脂质相关蛋白基因突变分析六、血脂和脂蛋白检测的临床应用P95一、血浆脂质测定（一）TG测定

1．化学法

2．酶法测定（二）TC测定

1．化学法

2．酶法测定（三）FFA测定（四）磷脂测定（一）甘油三酯测定

1．化学法

基本操作步骤包括：①抽提分离（有机溶剂），去除干扰物—PL、FG等（吸附剂）或分溶抽提；②皂化使TG水解生成甘油；氧化甘油氧化成甲醛；④显色定量甲醛。

A.甲醛与变色酸在硫酸溶液中加热产生紫红色（Eegriwe反应），570nm测定吸光度。

B.甲醛与乙酰丙酮在铵离子存在下加热生成黄色的产物（Hantgsch反应），412nm测定吸光度。2．甘油三酯酶法测定评价：操作简便，快速准确，并能在自动化生物化学分析仪上进行批量测定。

TG参考范围与临床意义血清TG参考范围：成人0.45-1.69mmol/L（40-150mg/dl）。目前我国的血脂异常防治建议提出，成年人的合适TG水平≤1.69mmol/L（150mg/dl）；＞1.69mmol/L为TG升高。TG升高可见于家族性高TG血症、家族性混合性高脂血症、冠心病、动脉粥样硬化、糖尿病、肾病综合症、甲状腺功能减退、胆道梗塞、糖原累积症、妊娠、口服避孕药、酗酒等。（二）总胆固醇测定血清中胆固醇：CE占70％；FC占30％。测定方法分为化学法和酶法两大类。1．化学比色法一般包括：①抽提；②皂化；②毛地黄皂苷沉淀纯化；④显色比色四个阶段。代表性的方法：（1）硫磷铁法（Bowman法）：用无水乙醇提取胆固醇，沉淀蛋白质，提取液中加硫磷铁试剂显色。（2）Abell法：血清中加入氢氧化钠乙醇溶液，使CE皂化为FC；加入正己烷-水提取后，FC进入正己烷相，以醋酐-硫酸试剂显色定量。2.总胆固醇酶法测定（1）CE在胆固醇酯酶(cholesterolesterase，CHE)作用下水解成FC和FFA；（2）FC再经胆固醇氧化酶(cholesteroloxidase，COD)氧化成△4胆甾烯酮和H2O2；（3）再分别定量O2的消耗或者H2O2的生成量，或者△4胆甾烯酮生成量，以作为FC的定量依据。A.测定△4胆甾烯酮法240nmB.定量O2的消耗电位测量C.测定H2O2的生成量TC参考范围与临床意义血清TC参考范围：成人2.85-5.69mmol/L（110-220mg/dl）。高胆固醇血症和AS的发生有密切关系。TC升高见于各种高脂蛋白血症、梗阻性黄疸、肾病综合征、甲状腺功能低下、慢性肾功能衰竭、糖尿病等。此外，吸烟、饮酒、紧张、血液浓缩等也可使TC升高。TC降低见于各种脂蛋白缺陷状态、肝硬化、恶性肿瘤、营养不良、巨细胞性贫血等。（三）游离脂肪酸测定

FFA在血中浓度很低，成人0.4～0.9mmol/L；儿童和肥胖成人稍高。FFA测定标本：在4℃条件下分离血清并进行测定。血清FFA测定方法：

1．非酶法测定非酶法测定包括滴定法、比色法、原子吸收分光光度法和高效液相层析法。前三种方法准确性差，高效液相层析法仪器太昂贵，不便于批量操作。

2．酶法测定血清中主要用脂肪酶测定。可分别测定产物乙酰CoA，进行定量。酶法测定结果准确可靠快速，易于批量检测。（四）磷脂测定血清中PL包括：卵磷脂(60％)；溶血卵磷脂(2％～10％)；磷脂酰乙醇胺等(2％)；鞘磷脂(20％)。血清PL定量方法:1．化学测定法①抽提分离；②灰化；显色、比色。

2．酶测定法可分别利用磷脂酶A、B、C、D等4种酶作用，水解，测定其产物，对PL进行定量，多采用磷脂酶D(PL-D)。PL-D可作用于含有卵磷脂、溶血卵磷脂和鞘磷脂以及含胆碱的磷脂，这三种磷脂约占血清总磷脂的95％。该法快速准确，便于自动化仪器进行批量检测。二、血浆脂蛋白测定（一）电泳法（二）超速离心法（三）脂蛋白胆固醇测定1．沉淀分离法

2．均相测定法

3．间接法（四）Lp(a)测定二、血浆脂蛋白测定

（一）电泳分离法原理：根据血浆脂蛋白电泳迁移率不同予以判断确认。方法：（1）预染、电泳:如苏丹黑B等预染后电泳；（2）扫描、计算：置于光密度计内进行扫描，计算出各种脂蛋白的百分比。电泳支持物一般常用醋酸纤维薄膜、琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶。（二）超速离心分离纯化法操作方法：将血浆置于密度梯度的盐溶媒介质中，在强大离心力作用下，各脂蛋白分散于离心管中的密度梯度溶媒层，达到分离纯化的目的。超速离心法是分离纯化脂蛋白的有效技术,目前广泛应用于脂蛋白、载脂蛋白代谢的研究中。

（三）血浆脂蛋白胆固醇测定脂蛋白中胆固醇含量较为稳定，因此目前以测定脂蛋白中胆固醇总量的方法作为脂蛋白的定量依据。高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)极低密度脂蛋白-胆固醇(VLDL-C)1.沉淀分离法原理：脂蛋白的组成及理化性质不同，在不同的聚阴离子、2价金属离子(Mn2+，Mg2+、Ca2+、Ni2+、Co2+)及不同pH值条件下，使脂蛋白与聚阴离子结合形成复合物沉淀，以达到分离定量各种脂蛋白的目的。方法：（1）肝素-锰沉淀血清中VLDL和LDL，离心沉淀，HDL则留在上清液，再定量HDL-C量，即为血浆HDL的量。（2）聚乙烯硫酸盐沉淀LDL，离心去上清液留沉淀。再定量沉淀其中的LDL-C，即血浆的LDL量。评价：操作简单，无需昂贵的仪器，是临床应用的检测方法。

2．匀相测定法

（1）血浆高密度脂蛋白胆固醇测定

原理：CM、VLDL、LDL在多聚阴离子存在下与试剂Ⅰ发生凝集形成遮避圈，抑制其表面的游离胆固醇反应或试剂Ⅰ与CM、VLDL、LDL中的胆固醇反应生成H2O2，并将H2O2清除；试剂Ⅱ与HDL形成可溶性复合体，使HDL中的胆固醇直接与酶试剂反应。过氧化物酶清除法测定HDL-C在血清中加入试剂Ⅰ，在反应促进剂（合成的多聚物/表面活性剂）的作用下，血清中CM、VLDL及LDL与试剂形成可溶性复合物，其表层的FC在CHOD的催化下反应生成H2O2，H2O2在POD的作用下被清除。加入试剂Ⅱ，与HDL颗粒成为可溶性复合物，HDL中的胆固醇与胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶反应，生成H2O2，并作用于色原体产生颜色反应，其颜色的深浅与HDL-C的含量成正比。HDL-C参考范围与临床意义血清HDL-C参考范围：成年男性1.16-1.42mmol/L（45-55mg/dl）女性1.29-1.55mmol/L（50-60mg/dl）HDL-C与冠心病的发展成负相关。HDL-C降低见于急性感染、糖尿病、慢性肾功能衰竭、肾病综合征等。HDL-C含量过高（如超过2.6mmol/L），也属于病理状态，为高HDL血症。高HDL血症可分为原发性和继发性两类。（2）血浆LDL-C测定——表面活性剂清除法SUR法检测原理：试剂Ⅰ中的表面活性剂1能改变LDL以外的脂蛋白（HDL、CM和VLDL等）结构并解离，所释放出来的微粒化胆固醇分子与胆固醇酶试剂反应，产生的H2O2在缺乏偶联剂时被消耗而不显色；加试剂Ⅱ，表面活性剂2使LDL颗粒解离释放胆固醇，参与Trinder反应而显色，色泽深浅与LDL-C量呈比例。LDL-C参考范围与临床意义血清LDL-C参考范围：成人2.07~3.11mmol/LLDL是AS的主要危险因素之一。血清LDL-C水平随年龄、高脂、高热量饮食、运动少和精神紧张升高。LDL-C升高可见于家族性高胆固醇血症、家族性apoB缺陷症、混合性高脂血症、糖尿病、甲状腺功能低下、肾病综合征、梗阻性黄疸、慢性肾功能衰竭、Cushing’s综合征、妊娠、多发性肌瘤、某些药物的使用等。LDL-C降低见于家族性无β或低β-脂蛋白血症、营养不良、甲状腺功能亢进、消化吸收不良、肝硬化、慢性消耗性疾病、恶性肿瘤等。（四）Lp(a)测定法目前主要采用免疫透射比浊法（ITA）、免疫散射比浊法(INA)、酶联免疫吸附试验（ELISA）、发射免疫测定法（RIA）和免疫扩散法（RID）。免疫透射比浊法：利用Apo(a)的单克隆抗体，与Apo(a)结合进行测定，该法灵敏度高，便于自动化批量检测。Lp(a)-C测定法：避免或减少因为抗原Apo(a)多态性不同所造成的Lp(a)定量的准确性。测定方法有超速离心法、麦胚血凝素法和琼脂糖凝胶电泳法，后两种方法在临床应用较广。参考值：300mg/L以下三、载脂蛋白测定血清载脂蛋白(Apo)包括ApoAI、AⅡ、B100、CⅡ、CⅢ、E和(a)，已属常规检测项目。血清中载脂蛋白均结合于脂蛋白中，测定时要加用解链剂，使脂蛋白中Apo暴露再进行测定。目前测定血清中载脂蛋白的含量的方法是利用相应特异抗体试剂进行测定。现有羊抗人ApoAI、AⅡ、B100、CⅡ、CⅢ、E和(a)等抗体试剂。测定原理是将某一特异抗体加到待测人血清中，即与血清中相应抗原形成抗原抗体复合物，根据复合物的