生化实验课件 课件6-酶的性质及酶动力学常数测定2015

授课老师：李民第8周（11月9日~11月13日）酶学实验

III.酶的性质及

酶动力学常数测定生物化学实验五酶是指具有生物催化功能的高分子物质:

高效性：酶的催化效率比无机催化剂更高，使得反应速率更快。

专一性：一种酶只能催化一种或一类底物。

多样性：酶的种类很多，大约有4000多种。

温和性：是指酶所催化的化学反应一般是在较温和的条件下进行的。

活性可调节性：包括抑制剂和激活剂调节、变构调节等。

易变性：除少数核酶外，绝大多数酶都是蛋白质，因而会被高温、强酸、强碱等破坏。有些酶的催化性与辅因子有关。

酪氨酸酶是黑色素生物合成过程（melaninbiosynthesispathway）中的关键限速酶。

黑色素是一种生物色素，是酪氨酸或3,4-二羟苯丙氨经过一连串化学反应所形成。

熊果苷（arbutin）是酪氨酸酶的抑制剂。

Steadystateassumption[E]<<[S],[ES]维持不变类型VmaxKm无抑制剂VmaxKm竞争性抑制剂不变增大非竞争性抑制剂减小不变反竞争性抑制剂减小减小混合型抑制剂减小减小或增大（1）利用倍半稀释法将16mM的L-DOPA梯度稀释至所需浓度。（2）在12联酶标管中按下表加入缓冲液和多巴溶液，振荡均匀。注意标记样池号。（3）用排枪加入酶液后，精确计时5min后在酶标仪中测490nm处吸光度。（4）计算v，[S]（5）作v-[S]曲线和1/v-1/[S]曲线，分别拟合后求酪氨酸酶的Km和Vmax值试剂管号12345678910L-DOPA(μL)050(0.0625mM)50(0.125mM)50(0.25mM)50(0.5mM)50(1mM)50(2mM)50(4mM)50(8mM)50(16mM)PBS缓冲液(pH7.5)(μL)150100100100100100100100100100纯酶液(μL)50505050505050505050（1）利用倍半稀释法将4mM的熊果苷稀释至2mM备用。（2）在12联酶标管中按下表加入缓冲液,L-DOPA和不同浓度的熊果苷溶液，振荡均匀。每个浓度的熊果苷溶液做一排管，注意标记样池号。（3）用排枪加入酶液后，精确计时5min后在酶标仪中测490nm处吸光度。（4）计算v，[S]（5）作v-[S]曲线和1/v-1/[S]曲线，分别拟合后求出酪氨酸酶的Km和Vmax值试剂管号12345678910L-DOPA(μL)050(0.0625mM)50(0.125mM)50(0.25mM)50(0.5mM)50(1mM)50(2mM)50(4mM)50(8mM)50(16mM)PBS缓冲液(pH7.5)(μL)500000000002或(4mM)熊果苷(μL)100100100100100100100100100100纯酶液(μL)50505050505050505050无抑制剂低浓度抑制剂高浓度抑制剂重点：如何根据动力学曲线判断抑制剂类型最优反应条件-温度,pH

倍半稀释法稀释L-DOPA溶液和熊果苷溶液根据教材的列表分别在3个12联管内加入L-DOPA、PBS缓冲液和熊果苷溶液加入酶液，计时测490nm处各管吸收值温度对酶活力的影响实验pH对酶活力的影响实验测480nm处各管吸收值利用倍半稀释法，将8mM和16mM的L-DOPA分别稀释至需要浓度。16mM的L-DOPA稀释至：8mM、4mM、2mM、1mM、0.5mM、0.25mM、0.125mM和0.0625mM，起始管溶液体积为500μl，每管终体积为250μl。使用多道移液器（排枪）可有效提高加样速度，减少因孔间加样时间差异导致的实验误差。其操作关键原则是：减少孔间吸样差异。1.确保每个枪头连接紧密；2.缓慢吸液；3.靠壁放液；4.防止污染。使用加样槽，可减少样品损耗。先用1000μL移液器吸取2mL酶液至加样槽内，再进行排枪吸液操作。每次连接5个枪头，中途不用更换枪头。Vmax,mol/L/min3.366e-0052.462e-0051.918e-005Km,

mol/L0.00021960.00031280.0003044方程Y=6.939*X+28995Y=9.798*X+46347Y=12.94*X+57853R20.96690.96040.9703Vmax3.345e-005

mol/