细胞生物学技术

细胞生物学技术第1页/共89页加拿大1973拉尔夫·斯坦曼法国1996朱尔斯·霍夫曼美国1998布鲁斯·博伊特勒诺贝尔生理学或医学奖评审委员会3日认定，本年度3名获奖者“发现免疫系统激活的关键原理，革命性地改变我们大家对免疫系统的理解”“先天性免疫系统的活性作用方面的发现”树状细胞及其在适应性免疫系统方面作用的发现”第2页/共89页

传统意义上，疫苗的作用，在于预防。而以3人所获研究成果为基础，新型疫苗着眼于以新颖手段治疗癌症，获称“治疗性疫苗”，旨在调动人体免疫系统对肿瘤发起“攻击”。另外，他们的成果有助于治疗一些炎症类疾病，如风湿性关节炎。第3页/共89页拉尔夫·斯坦曼

诺贝尔生理学或医学奖评审委员会3日确认，2011年度诺贝尔医学奖得主之一、斯坦曼9月30日因胰腺癌去世，终年68岁。

第4页/共89页细胞是生物体的结构和功能单位。一切生命的关键问题都要在细胞里面寻找(1925,Wilson)。第5页/共89页

细胞生物学

(cellbiology)是从细胞整体、超微和分子水平上研究细胞的结构功能和生命活动规律的科学。结构功能第6页/共89页细胞的形态结构普通光学倒置荧光激光扫描共聚焦电镜第7页/共89页免疫组织化学技术放射自显影术流式细胞术细胞器组分的分析、分离技术细胞内化学组分测定分析第8页/共89页

细胞生物学

(cellbiology)是从细胞整体、超微和分子水平上研究细胞的结构功能和生命活动规律的科学。结构功能第9页/共89页第五章细胞生命现象的研究技术◆细胞生长增殖研究技术◆细胞凋亡研究技术◆细胞遗传学研究技术◆肿瘤细胞学研究技术◆药物测试的细胞模型◆膜片钳术第10页/共89页

第一节细胞生长增殖研究技术二、细胞周期分析技术细胞同步化实验流式细胞仪检测细胞周期通过分析CDK的活性检测细胞周期一、细胞增殖生长力（判定细胞活力）细胞计数细胞分裂指数细胞集落形成实验

3H-TdR渗入法(氚标记胸腺嘧啶核苷)MTT检测细胞生长状况第11页/共89页一、细胞增殖生长力（一）细胞计数——细胞生长曲线的绘制意义：了解培养细胞增殖详细过程和细胞生长基本规律分时间段连续取材计数生长曲线第12页/共89页细胞生长是否稳定细胞增殖速度变化的进程增殖高峰出现的时间

细胞传代确定细胞冻存最佳时间

实验研究第13页/共89页细胞生长曲线绘制实验范例实验用品

▲材料贴壁培养的细胞。

▲器材24孔培养板、吸管、胶帽、离心管、培养皿、半对数坐标纸、盖玻片、细胞计数板、酒精棉球、酒精灯、离心机、倒置显微镜、普通光学显微镜、超净工作台、CO2培养箱。

▲试剂Hanks液、DMEM培养基(含10%小牛血清)、0.25%胰蛋白酶消化液、吉姆萨染液。第14页/共89页实验步骤消化弃上清离心制悬液计数接种（2×104～5×l04个/ml）（96孔板，平行3孔）消化计数（细胞数/ml）培养时间为横坐标细胞数为纵坐标绘制细胞生长曲线培养细胞24h48h72h96h7d/孔平均值/孔第15页/共89页S细胞无增殖少见分裂相细胞增殖最旺盛活力最好实验最佳阶段细胞增殖饱和细胞停止增殖（停滞期）104105106第16页/共89页有限、无限细胞系一代生长曲线比较无接触抑制接触抑制第17页/共89页1、在进行生长曲线测定时，接种到培养板孔中的细胞数量应保持每孔一致（2×104~5×l04个/ml）

。2、接种量应适当，不能过少或过多，过少将使细胞生长周期延长，过多将导致细胞在实验未完成前即需传代，这两种情况下所得到的生长曲线均不能较准确地反应细胞的生长状况。不足：活细胞和死细胞同时被计数，误差较大。

注意事项第18页/共89页（二）细胞分裂指数（mitoticindex,MI）：——绘制细胞分裂指数曲线意义：表示细胞增殖旺盛程度第19页/共89页PhasesoftheCellcycle

●Interphase:▲G1▲

S▲

G2●divisionphase(mitosisphase-Mphase)▲Nucleardivision(Karyokinesis)▲

cytoplasmicdivision(Cytokinesis)

第20页/共89页实验步骤

消化离心制悬液计数接种（2×104-5×l04个/ml有盖玻片的培养皿中）固定染色冲洗培养细胞

每24h

取盖玻片（95%乙醇）（吉姆萨）镜检晾干

盖玻片反扣在载玻片上（对光观察，细胞面发亮）（选高、中、低3个不同区域各1000个细胞）计分裂细胞数平均值细胞分裂指数

细胞核紫红色，胞浆蓝、灰蓝、红或多色性，核仁染深蓝色观察结构，判定是否为分裂相第21页/共89页P130改错：（1）（2）（3）（4）（5）按2×104~5×104/ml的密度将细胞接种于置有盖玻片的培养皿中。（5）每24h取出1张盖玻片，经95%乙醇固定5min.。（6）用吉姆萨染液对盖玻片的细胞染色10min。（7）高倍镜下观察细胞结构，对分裂期细胞及非分裂期细胞加以识别。（8）选出细胞密度高、中、低3个不同的区域，每一区域观察1000个细胞，统计并记录其中的分裂细胞数。（9）计算上述3个区域的分裂细胞数平均值。（10）求出分裂细胞在1000个细胞中所占的比例，即可得培养细胞在不同时相点的分裂指数。（11）以各时相点为横坐标，各时相点时细胞的分裂指数为纵坐标，绘制培养细胞分裂指数曲线。第22页/共89页细胞分裂指数曲线细胞分裂指数和细胞数量关系第23页/共89页细胞分裂指数注意事项掌握好确定分裂相标准，其中主要是确定好划分间期和前期、末期和间期等的界限，当两人以上进行观察时更须如此，并始终一致，否则会发生人为误差。细胞分裂指数曲线与生长曲线趋势基本一致，但不完全相同，如当细胞增长达饱合密度并进入停止期后，细胞数值很大，而分裂相可完全消失。操作时动作要轻，以免使盖片上的细胞脱落。

第24页/共89页（三）细胞集落形成实验意义：检验活细胞的增殖能力，避免了在生长曲线绘制时将死细胞或不能分裂细胞计数在内而导致的实验结果误差。第25页/共89页原理：单个细胞在体外持续增殖6代以上，其后代形成一个细胞群体，称为集落或克隆。每个克隆均包含50个细胞以上，大小在0.3~1.0mm之间。通过计算克隆形成率，来测定测试细胞的增殖能力。第26页/共89页影响集落形成率的因素：培养液血清质量、浓度温度酸碱度细胞密度

一般情况下：初代培养细胞集落形成率低，传代细胞较高；正常细胞较低，转化细胞较高。第27页/共89页应用：干细胞研究肿瘤研究：肿瘤是由不同增殖及分化能力的瘤细胞群构成，其中仅有部分具有自我更新能力，即肿瘤干细胞。目前认为，只有肿瘤干细胞具有形成集落的能力。

细胞集落形成实验可以作为抗肿瘤药物或致癌物质检测的有效手段。第28页/共89页

以集落抑制率与药物剂量对数作图，可以得到一条S形曲线，作出药物的IC50（半数抑制率——细胞生长抑制率为50%时的药物浓度值）。对于抗癌药物而言，集落抑制率或集落存活分数是重要的指标第29页/共89页集落抑制率与药物剂量间的关系第30页/共89页第31页/共89页

细胞集落形成——实验范例（平板克隆形成实验、软琼脂集落形成实验）实验用品：（平板克隆形成实验）材料：HeLa细胞试剂：1640培养液、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、吉姆萨染液。设备：细胞计数板、60mm培养皿、10ml移液管、小烧杯、10ml吸管橡皮头、超净工作台、培养箱、倒置显微镜、离心机、水浴锅。

第32页/共89页实验步骤：200个/ml，接种于24孔板，4个平行孔，每孔加入1ml（950µl细胞悬液50µl药液）培养（2~3周，肉眼可见克隆）（甲醇：冰醋酸＝3：1）计算第33页/共89页第34页/共89页

第一节细胞生长增殖研究技术二、细胞周期分析技术细胞同步化实验流式细胞仪检测细胞周期通过分析CDK的活性检测细胞周期一、细胞增殖生长力（判定细胞活力）细胞计数细胞分裂指数细胞集落形成实验

3H-TdR渗入法(氚标记胸腺嘧啶核苷)MTT检测细胞生长状况第35页/共89页（四）3H-TdR渗入法（氚标记胸腺嘧啶核苷）

——DNA合成速度意义：反映细胞增殖水平动态观察细胞复制分裂情况，确定细胞周期各期时间原理：3H-TdR能特异掺入DNA合成（S

期），使新合成的DNA带核放射性，掺入量和合成DNA的速度正相关。

第36页/共89页interphase2NDNA4NDNA4NDNA2NDNA第37页/共89页3H-TdR渗入法

实验用品材料贴壁培养的细胞器材液闪计数器（液体闪烁计数器

）。试剂标记物5µCi[methyl-3H]-TdR/ml（5微居里甲基氚标记胸腺嘧啶核苷/毫升），用培养液配成、PBS、0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合消化液。第38页/共89页

实验步骤24h~48h12h~24h加含培养液弃原培养液3H-TdR清洗PBS消化收集细胞提取DNA滤出DNA放射性脉冲数/min烘干结果分析被标记的为S期细胞3H-TdR渗入量反映DNA含量（2×104-5×l04个/ml24孔培养板）（液闪计数器）第39页/共89页肿瘤研究上有重要意义：筛选抗肿瘤药物种类确定剂量，用药时间制定化疗方案判定疗效预后研究干预因素3H-TdR渗入法（氚标记胸腺嘧啶核苷）

第40页/共89页直接计数法——工作量大3H-TdR渗入法——具有放射性限制应用1983年Mosmann提出：——

MTT检测细胞生长状况第41页/共89页优点：灵敏性高重复性好操作简便经济安全广泛应用第42页/共89页MTT法（四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法）。MTT是一种噻唑盐，化学名3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名为噻唑盐。水溶液为黄橙色。（五）MTT检测细胞生长状况第43页/共89页原理：+活细胞死细胞MTT线粒体琥珀酸脱氢酶难溶性的蓝紫色结晶物甲臜(沉积细胞中)外源的+二甲基亚砜（DMSO）甲臜溶解+酶标仪光吸收值（OD值）

490nm

此酶消失不形成甲臜※可间接反应活细胞数量：在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成与活细胞数成正比，OD值与活细胞数目成正比。

第44页/共89页MTT法——实验范例实验用品：材料：HeLa细胞试剂：1640培养液、胎牛血清、0.25胰蛋白酶、二甲基亚砜、MTT溶液。设备：96孔板、10ml移液管、小烧杯、10ml吸管橡皮头、超净工作台、培养箱、倒置显微镜、离心机、水浴锅、混合振荡器、酶联免疫检测仪。

第45页/共89页（96孔板，200µl/孔

1000~10000个/孔）

培养（3~5d）MTT20µl孵育4h弃上清150µlDMSO

振荡10min

OD普通MTT法实验步骤（4000较好）第46页/共89页

以时间为横坐标，以细胞数目或OD值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。第47页/共89页注意事项：血清会干扰OD值，所以在显色后尽可能将孔内残余培养基吸净。设空白对照：不加细胞仅加培养基的空白对照孔，其他实验步骤保持一致。比色时，以空白孔调零。第48页/共89页应用：抗癌药物研究——通过比较对照与处理组间细胞的存活率，可以判断抗癌药物的作用强度。细胞增殖抑制率=(1–实验组OD值/对照组OD值)×100%第49页/共89页（96孔板，200µl/孔

1000~10000个/孔）

培养（3~5d）MTT20µl孵育4h弃上清150µlDMSO

振荡10min

OD普通MTT法实验步骤（4000较好）第50页/共89页药物MTT法实验步骤培养（96孔板，100µl/孔

1000~10000个/孔）

OD4h100µlDMSO

振荡10min

加药（100µl/孔

5个复孔）16~48hMTT10µl第51页/共89页OD小，细胞存活率低，抑制率高OD大，细胞存活率高，抑制率低第52页/共89页MTT一些细节问题4000～5000个／孔105第53页/共89页第54页/共89页第55页/共89页第56页/共89页第57页/共89页

第一节细胞生长增殖研究技术二、细胞周期分析技术细胞同步化实验流式细胞仪检测细胞周期通过分析CDK的活性检测细胞周期一、细胞增殖生长力细胞计数细胞分裂指数细胞集落形成实验

3H-TdR渗入法(氚标记胸腺嘧啶核苷)MTT检测细胞生长状况第58页/共89页二、细胞周期分析技术细胞同步化实验流式细胞仪检测细胞周期（见第四章）通过分析CDK的活性检测细胞周期第59页/共89页细胞周期分析技术（一）细胞同步化实验同步化类型自然同步化人工同步化第60页/共89页自然同步化：自然界中存在一些群体处于细胞周期的同一时期例1粘菌的显型原质团：只进行核分裂而不进行胞质分裂，同一细胞质中可达108个细胞核，细胞直径可达5~6cm。第61页/共89页第62页/共89页许多动物：雌性一次产多个卵（处于同一时期）例2受精受精卵同步卵裂同步化细胞群体第63页/共89页概念：利用药物或其他方法使细胞停止在细胞周期的某个时相。（人为地将处于不同时期的细胞分离开来，从而获得不同时期的细胞群体）。特点：可调节、可恢复意义：为特定细胞周期转变、细胞动力学、细胞周期调控以及细胞在不同时相中对药物的敏感性研究奠定基础。人工同步化第64页/共89页

温度休克法短时间饥饿法药物抑制法离心淘洗法

使细胞停留在细胞周期的不同时相第65页/共89页细胞周期中的检验点蛋白质或多肽第66页/共89页人工同步化——实验范例（1）实验用品材料：HeLa细胞。器材：培养瓶、移液器、枪头、小烧杯、10ml吸管橡皮头、超净工作台、CO2孵箱、倒置相差显微镜、离心机。试剂：无血清培养基、胎牛血清、1640培养液、0.25%胰蛋白酶溶液、PBS。第67页/共89页（2）实验步骤血清饥饿法（将细胞周期阻滞在G0/Gl）对数生长期HeLa细胞消化、离心、弃上清pH7.4，37℃预温的PBS或无血清培养基洗涤血清浓度低于0.5%的培养基中培养24～48h换为正常血清浓度的培养液，使细胞重新进入细胞周期细胞约在12h后进入S期细胞周期阻滞在G0/Gl※（时间过长不可逆或凋亡）（流式检测细胞均一性)第68页/共89页对数生长期HeLa细胞胸苷法（诱导细胞停滞在G1/S期交界）：添加含2mmol/L胸苷新鲜培养液，培养12h弃去含有胸苷的培养液，用完全培养液洗涤2次鲜培养液孵育16h。细胞停滞在G1/S期交界（流式检测细胞均一性)第69页/共89页

原理：在细胞进入有丝分裂时（尤其在分裂中期）胞体变圆，和附着底物接触面积变小。在这种情况下稍加外力便可使分裂细胞从底物上脱落下来。然后再分离收集脱落细胞进行分离培养，便可获得一定数量的同步化细胞群。有丝分裂摇落法（将细胞截获于M期）：第70页/共89页有丝分裂摇落法（将细胞截获于M期）：对数生长期HeLa细胞3m10.1%胰蛋白酶消化5min收集松动细胞(分裂期)，离心，培养6h弃去未贴壁的细胞（死），洗涤2次，继续培养10h轻摇培养瓶，收集M期细胞离心，孵育2h，细胞进入G1期（流式检测细胞均一性)时间过长，其他周期细胞增加第71页/共89页哺乳动物细胞周期时间是10~30h，S+G2+M=10h,M≈30~60min第72页/共89页有丝分裂摇落法（将细胞截获于M期）：对数生长期HeLa细胞3m10.1%胰蛋白酶消化5min收集松动细胞(分裂期)，离心，培养6h弃去未贴壁的细胞（死），洗涤2次，继续培养10h轻摇培养瓶，收集M期细胞离心，孵育2h，细胞进入G1期（流式检测细胞均一性)时间过长，其他周期细胞增加第73页/共89页补充说明：一般细胞在指数生长期时，分裂期的细胞仅占1%~5%，数量还不够充分。为增加分裂相数，一般可并用其它能扩大分裂指数的措施如低温休克、秋水仙素阻滞分裂中期法等，其中以低温休克简而易行，对细胞的损伤小。低温休克法原理：随着细胞温度降低，细胞DNA的合成会受抑制或停止，使很多细胞阻滞趋于G1期，当恢复37℃培养液后，过一定时间，多量细胞可同步进入S期，随之便出现一个明显的细胞分裂高潮。第74页/共89页低温处理法对数生长期细胞傍晚4℃，2~10h（G1期，细胞分裂受阻能持续16~20h）37℃培养6~12h次日晨取出培养瓶（80%细胞为分裂期）吸除培养液（去除死和未贴壁细胞）加入新培养液，水平横向摇动，冲刷细胞层倒出培养液，装入另一培养瓶，得同步化分裂细胞第75页/共89页（二）流式细胞仪检测细胞周期

第76页/共89页（三）通过分析CDK的活性检测细胞周期第77页/共89页细胞周期中的检验点蛋白质或多肽第78页/共89页MPF（matuation-promotingfactor,促成熟因子）MPF=cyclin-CDK（异质二聚体）Cyclin:周期蛋白(调控亚基，含量呈周期性变化)CDK（cyclin-dependentkinase）:周期蛋白依赖性蛋白激酶(催化亚基，含量稳定，活性周期的变化受Cyclin调节)CDKI(CDKinhibition):周期蛋白依赖性激酶抑制因子(细胞周期中负调控作用)

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