细胞培养技术广东医科大学临床医学研究中心

细胞培养技术广东医科大学临床医学研究中心第1页/共51页细胞培养技术

第一节 细胞培养基本知识第二节 细胞培养的基本技术第2页/共51页第一节 细胞培养基本知识一、前言二、培养细胞的特性三、培养细胞的生长过程四、培养细胞生长的条件第3页/共51页一.前言1.细胞培养概念2.细胞培养的主要优点3.细胞培养的研究方面4.细胞培养的应用领域第4页/共51页1.细胞培养(cellculture)概念从生物体内取出细胞或组织，在体外模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下进行孵育培养，使之生存和生长并维持其结构和功能的技术。第5页/共51页体内、外细胞的差异体内细胞：

机体神经体液调节和其他类型细胞影响 基因表达受到外来信号调节 增殖过程中不断发生着分化（由一般到特殊） 高度特化的结构和功能体外细胞：失去机体神经体液调节和其他类型细胞影响细胞的许多外来信号被切断特定分化基因表达减弱或停止而进化中保守的增殖活动维持（由特殊到一般）与体内细胞结构和功能的差异特征：失去原有形态，分化特性减弱 形态和功能趋于单一 一定代数后衰老死亡， 或发生转化， 获不死性而成为能无限传代第6页/共51页2.细胞培养的主要优点研究对象是活的细胞研究的条件可以人为地控制研究的样本，可以达到比较均一性研究的内容便于观察、检测和记录研究的范围比较广泛，多种学科均可利用细胞培养进行研究研究的费用相对较经济第7页/共51页3.细胞培养的研究方面1）细胞内的活动：如能量代谢、DNA转录、调亡以及蛋白质的合成2）细胞内部与细胞外界之间的作用：如细胞对外界刺激的反应、药物对细胞的作用、细胞内产物分泌等3）细胞与细胞之间的相互作用：如形态发生、粘着作用、接触抑制、密度抑制等4）细胞内的流动：如信号的转导、钙离子的流动、RNA的移动、激素受体复合物的易位等5）遗传学：如遗传学分析、转染、转化等第8页/共51页4.细胞培养的应用领域1）病毒学2）免疫学3）遗传学4）肿瘤学5）分化及发育6）细胞毒试验7）临床医学及生物技术方面的应用第9页/共51页二、培养细胞的特性

培养细胞的生长特点贴附第10页/共51页贴附贴附是贴附类细胞生长增殖条件之一以成纤维细胞为例，一般在细胞接种后，很快（5-10min）便可见细胞以伪足初期附着，与底物形成一些接触点；接着细胞逐渐呈放射状地伸展开，细胞体的中心部分亦随之扁平；最后细胞成为成纤维细胞的形态。第11页/共51页1.培养细胞的生长方式及类型体外培养的细胞，按其生长方式可分为两大类：贴附型 为附着于底物（支持物）表面生长的细胞，生长中形成汇片。大多数细胞属此型。形态上失去在体内特有形态。大致分成以下四型：成纤维细胞型、上皮细胞型、游走细胞型、多形型

悬浮型第12页/共51页悬浮型少数细胞类型在体外培养时不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长，包括一些取自血、脾或骨髓的培养细胞，尤其是血液白细胞，以及癌肿瘤细胞。细胞在悬浮中生长良好，可以是单个细胞或为细小的细胞团，观察时细胞呈圆形。优点：可大量繁殖细胞、传代方便、易于收获细胞。第13页/共51页三.培养细胞的生长过程1.单个细胞的生长过程：细胞周期2.细胞系的生长过程3.每代细胞生长过程第14页/共51页1.细胞系的生长过程

取自动物并置于体外培养中生长的细胞在其传代之前为原代培养或原代细胞。当细胞持续生长繁殖一段时间，到达一定的细胞密度后，就应当将细胞分离成两部分（或更多）至新的培养器皿并补充更新培养液，此即称为传代或再培养。传代生长以后便成为细胞系。体外培养细胞寿命的过程一般可分为三个阶段：原代培养传代期衰退期第15页/共51页原代培养：从体内取出细胞接种后到第一次传代。一般维持1－4周。传代期：传代大约数天至1周左右即可重复一次，持续数月，一般传10－50代。随后细胞增殖缓慢以至完全停止，细胞进入衰退期。衰退期：细胞增殖缓慢以至完全停止，细胞死亡。无限细胞系:

永久增殖。第16页/共51页无限细胞系多发生在传代期末或衰退期，由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化。转化的标志之一是细胞可能获得永生性或恶性性。细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系，也称连续细胞系。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体。细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。第17页/共51页2.每代细胞的生长过程传代： 培养容器中细胞增殖至一定密度后，分离出一部分细胞和更新营养液的过程一代:

细胞接种后到下一次传代的一段时间在细胞一代中，细胞能倍增3～6次细胞一代的三个阶段： 潜伏期、指数增生期、平台期实验研究多在指数增长期进行。第18页/共51页四、培养细胞生长的条件

体外培养的细胞需要合适的环境和必须的条件才能生存、繁殖1.细胞的营养需要2.细胞培养环境条件3.无污染及无毒第19页/共51页一.细胞的营养需要基本营养物质与体内相同，包括糖、氨基酸、维生素、无机离子、微量元素。促生长因子等物质血清中含有多种生长因子等活性物质，有利于多数细胞的存活和生长；但同时也有些组成不明、对细胞有害的成分。第20页/共51页两类基本培养液

生长培养液 维持培养液

基本培养液 80～90％ 95～98％血清 10～20％ 2～5％第21页/共51页特殊培养基

提供特殊细胞所需的特定营养成分和生长因子。

基本营养成分含量改变： 高糖加入中间代谢产物： 辅酶A、ATP、丙酮酸钠激素： LH/FSH、胰岛素生长因子和细胞因子： EGF、FGF、BFGF特异性小分子物质： 维甲酸LIF(白血病抑制因子)维持胚胎干细胞的未分化状态饲养层细胞（feederlayer） 第22页/共51页选择培养基（条件培养基）

提供特殊的成分以造成只允许特定细胞生长的条件。

特殊抗菌素： 新霉素、潮霉素

－用于筛选导入基因阳性克隆2.特殊物质： 特异性生长因子 （配合血清撤除、饲养层撤除等）

－用于原代细胞筛选培养和干细胞诱导分化

第23页/共51页二.细胞培养环境条件温度 35~37℃气体 95%空气/5%CO2酸碱度 pH7.2~7.4（酚红指示）渗透压 =血浆渗透压290Osm/kg支持物 玻璃、塑料、饲养层、微载体培养细胞浸浴于培养液，生长在置于恒温、恒湿的二氧化碳孵育箱中的玻璃或塑料容器中。第24页/共51页第二节细胞培养的基本技术一、无菌操作基本技术二、培养基配制三、冷冻细胞活化四、细胞传代培养五、细胞计数与存活测试六、细胞冷冻保存七、收到细胞的处理方式第25页/共51页一、无菌操作基本技术1.实验进行前，无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30-60分钟灭菌，以75%酒精擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操作。

2.无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，实验用品以75%酒精擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。3.小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45℃角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。4.工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。第26页/共51页5.定期检测下列项目：

5.1.CO2钢瓶之CO2压力

5.2.CO2培养箱之CO2浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。

5.3.无菌操作台内之airflow压力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000小时/HEPA)。

第27页/共51页1.液体培养基贮存于4℃冰箱，避免光照，实验进行前放在37℃水浴中温热。

2.液体培养基(加血清)存放期为六个月，期间谷氨酰胺可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量谷氨酰胺。

二、培养基配制第28页/共51页三、冷冻细胞活化1.冷冻细胞的活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞死亡。

2.细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。

3.所需材料用品

37℃恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/离心管/培养瓶、液氮或干冰容器

第29页/共51页4.操作步骤：

1）操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。

2）自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。

3）将新鲜培养基置于37℃水浴中回温，回温后喷以70%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。

4）取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，以70%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。第30页/共51页5）取出0.9ml解冻细胞悬浮液，缓缓加入有培养基的培养容器内(稀释比例为1:10～1:15)，混合均匀，放入CO2培养箱培养。另取0.1ml解冻细胞悬浮液作存活测试。

6）解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO或甘油)，依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10ml培养基的离心管内，离心1,000rpm,5分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2

培养箱培养。

7）若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。第31页/共51页

四、细胞传代培养

1.细胞生长至高密度时，即须分殖至新的培养瓶中，一般稀释比例为1:3至1:6，依细胞种类而异。

2.材料用品：

PBS,0.25%胰酶,新鲜培养基

第32页/共51页3.步骤：

3.1.贴壁型细胞

1）吸掉旧培养液。

2）用PBS洗涤细胞一至二次。

3）0.25%胰酶37℃作用数分钟，于倒置显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，吸掉胰酶溶液。

4）轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入适量的新鲜培养基，以吸管上下吸放数次以打散细胞团块，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。第33页/共51页

3.2.悬浮型细胞(suspensioncell)

1）吸出细胞培养液，放入离心管中，离心1000rpm5分钟。

2）吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。

第34页/共51页五细胞冷冻保存1.冷冻保护剂浓度为5或10％DMSO，冷冻方法：

传统方法:4℃30分钟-->-20℃60分钟-->-80℃16-18小时(或隔夜)-->液氮槽蒸汽相中长期储存。

第35页/共51页2.材料用品

1）生长良好的培养细胞

2）新鲜培养基

3）DMSO(SigmaD-2650)

4）无菌塑料冷冻保存管(Nalgene5000-0020)

第36页/共51页3.操作步骤：

1）冷冻前一日前更换培养基，观察细胞生长。

2）配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMSO加入新鲜培养基中，最后浓度为5-10％，混合均匀，置于室温下待用。

3）依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。

4）离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1-5x106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全冷冻保存管中，1ml/小瓶，并取少量细胞悬浮液作污染检测。5）冷冻保存方法:冷冻管置于4℃30分钟→-60℃30分钟→-80℃16～18小时(或隔夜)→液氮槽蒸汽相长期储存。

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