刺吸电位技术在人工饲料上的应用

刺吸电位技术在人工饲料上的应用王雪丽(河南农业大学植物保护学院，郑州450002)摘要：刺吸电位技术(electricalpenetrationgraph，EPG)是研究刺吸式口器昆虫的重要手段，近年来，EPG在我国得到越来越广泛的应用，除了应用在植物上外，在人工饲料上的研究也越来越多，目前，由于在糖溶液中添加生物活性物质能够方便地研究单一物质的作用，因此利用人工饲料技术评价生物活性物质对刺吸式口器昆虫的影响，已经成为比较有效的方法。本文介绍了EPG在人工饲料上的使用方法及波形识别，为从事此项研究的科研工作者提供参考和借鉴。关键词：刺吸电位技术；人工饲料；刺吸式昆虫Abstract:electricalpenetrationgraph(electricalpenetrationgraph,EPG)isanimportantmeanstoresearchPiercing-SuckingInsect,inrecentyears,EPGhasbeenwidelyusedinourcountry,inadditiontotheapplicationinplantouter,therearemoreandmorestudiesontheartificialdiet,atpresent,AsitiseasytostudythefunctionofasingleBioactivesubstanceaddedinsugarsolution,Therefore,usingartificialdietsmethodtoevaluatetheeffectsofbioactivesubstanceonPiercingsuckinginsectshasbecomeaneffectivemethod.ThispaperintroducedtheusingmethodofEPGonartificialdietsandwaveformsrecognition,Toprovidereferenceandreferenceforresearchersintheresearch.Keywords:EPG;artificialdiet;Piercing-SuckingInsect,目前，刺吸电位技术(electricalpenetrationgraph，EPG)已经成为研究植食性刺吸式昆虫取食行为及其传毒机理、植物抗性机理、内吸性农药测定等的重要手段(Woodfordetal.,1990;Nisbetetal.,1992;Rahbeetal.,2000;Maucketal.,2010)，EPG技术的研究对象由最初的蚜虫已扩展到粉虱、叶蝉、蓟马等植食性刺吸式口器的昆虫，除了应用在植物上外，在人工饲料上的研究也越来越多，本文以烟粉虱为例，介绍EPG技术研究烟粉虱在人工饲料上取食行为的试验方法及波形识别。1、昆虫人工饲料的种类昆虫人工饲料是昆虫学研究的基本技术，自Bogdanow(1908)首次用肉汁、淀粉和蛋白胨等对黑颊丽蝇Calliphoravomitori^f人工饲喂以来，昆虫人工饲料的研究已逐步发展起来。Singh等(Sing&Moore，1985)曾收集了100多种昆虫的饲料配方和饲养方法。人工饲料已被广泛应用于基金项目：国家自然科学基金资助(批准号31471776)第一作者：王雪丽，E-mail:wxl2010@*通信作者：闫凤鸣,E-mail:fmyan@昆虫传播病毒机制(Harris&Maramorosch,1977)、营养生理(Kerkut&Gilbert,1985)、共生菌(Liadouzeetal.,1995;Douglas,1998)、毒理与杀虫活性物质生物测定(Gatehouseetal.,1996)以及昆虫与植物相互关系(Febvayetal.,1988;Sandstrom,1994;Fragoyannis&Mckinlaly,1998)等方面的研究。昆虫人工饲料大致分为三个类型(忻介六和苏德明，1979)：(1)全纯饲料，又称化学规定饲料或着规定饲料，其所有的组成成分均为纯化学物质。此类饲料多用于昆虫营养需求和代谢途径的研究中，也可用于测定寄主植物和某些特定的化合物等对昆虫的取食和生长发育的影响等；(2)半纯饲料，饲料成分中多为已知的纯化合物，并另含一种或是多种动植物或微生物的尚未经纯化的物质如动物组织、酵母产品等)的饲料。此类饲料中大多数的营养物质是由已纯化或着精制的物质所提供。在实验室中饲养昆虫饲料属多于此类；(3)实用饲料，又称半合成或半人工饲料，主要由天然物质制备的饲料，这种饲料被认为含有昆虫生长发育所需要的全部营养成分，且其中可能含有不被利用及不能消化的杂质。此类饲料较为经济，适合于昆虫的大规模饲养。2、EPG技术的原理在EPG整个电路中(图1)，昆虫电极是以导电金丝(长约1.5cm-3cm，直径10-20Mm通过导电银胶粘连在昆虫前胸背板上，植物电极是由可插入土壤中的铜棒构成。在昆虫的口针刺破植物表面，进入植物组织中时，回路被接通，当口针到达植物不同组织或同一组织不同层次时会引起昆虫导电性的变化，而这些变化经过电子转换和放大器放大后以波型的形式显示出来，且每一种波型在形状、电压值、频率等各方面各不相同，而不同的波型具有不同的生物学意义，通过对波型的分析便可以判断出昆虫不同的取食行为特征，并可对影响其取食的各种因素进行分析。在这里，植物极被包裹有人工饲料的囊膜取代，昆虫的口针刺破的不是植物表面而是囊膜。Vsystemvoltage(V■Vs+E+E)Vsvoltagesupply图1EPG原理示意图(Tjallingi,1988)3、EPG技术在人工饲料上的使用方法一一以烟粉虱为例3.1烟粉虱的固定及与金丝的连接在连接之前，首先要对烟粉虱进行处理。由于烟粉虱的活动性，需要将烟粉虱麻醉或者固定后再进行金丝电极连接，昆虫的固定一般采取负压法、冷冻法或CO2麻醉法(汤清波等，2011)。本实验室直接用冰袋冷冻烟粉虱，具体方法如下：将逮进离心管的若干头烟粉虱放在冰袋上冰冻或者直接在冰袋上划几下，烟粉虱即不能活动，大概几秒钟的时间，具体时间要看烟粉虱活动情况（离心管最好用1.5ml的离心管，在冰袋上划得时候容易操作）。等烟粉虱不能活动之后，即可进行电极的连接，电极与昆虫虫体的连接是一个技术难点（岳梅等，2005），即金丝表面比较光滑，横截面较小，很难聚集银胶，而试虫的连接需要一定的接触面积才能保证其牢固性。在实践中，我们将金线端部浸入银胶中，抽出后让附着的银胶在空气中干燥几秒，再将金线端部浸入银胶，如此反复至金线端部形成一个尽可能小的银胶球，连接在烟粉虱的前胸背板上，连接好烟粉虱之后，进行饥饿处理，饥饿时间视不同昆虫而定，虫体小的如烟粉虱，一般饥饿20min为宜。实验前的饥饿处理对于实验的成功与否至关重要，饥饿处理的时间过长，会造成实验过程中G波出现频繁（Johnson&Johnson，2002），饥饿时间过短会使第一个刺探前的时间太长。3.2人工饲料的制作人工饲料的制作可以用瓶盖作为实验工具，即在瓶口覆上一层封口膜，再在周围缠绕几圈封口膜，形成一个凹槽，在缠绕封口膜的同时将导电铜丝缠绕进去，以连接植物电极，然后在膜上滴上300-400uL的饲料，然后再覆上另一层膜，把周围封严即可。3.3EPG记录烟粉虱粘连好以及人工饲料制作好之后，就可以进行EPG记录了，EPG记录前应先进行仪器的调试、校正，把植物电极直接插进昆虫电极的探头中，使得回路接通，将植物电压的指针调到处于中间的位置，按下脉冲按钮，如果能够出现一个向下的5V的方波，就说明所测试通道正常，植物电压的调校不当会造成只有正的波形或者只有负的波形被记录的情况。将制作好的人工饲料中的铜线连接到植物电极上，将饥饿之后粘连有试虫的铜棒插入到昆虫电极的探头中，虫子端口针向下平放到饲料膜上，待所有虫子连接好后，点击start进行记录，即会在电脑上显示波形。4、人工饲料上EPG波形的识别在利用EPG开展研究之前，首先应了解所研究昆虫的取食特点。不同的昆虫取食植物的部位是不一样的。根据吸食部位，植食性刺吸式昆虫可分为3类（汤清波等，2011）:（1）韧皮部吸食：胸喙亚目昆虫如粉虱、蚜虫、介壳虫，半翅目蝽类等;（2）木质部吸食:头喙亚目昆虫如叶蝉、蝉等;（3）叶肉吸食：缨翅目蓟马类锉吸植物叶肉细胞，部分同翅目叶蝉类也属于这类。对于蚜虫、粉虱等同翅目胸喙亚目的昆虫，其AC-EPG或者DC-EPG波形及其生物学意义都很相似（表1）。EPG技术之所以可以作为研究刺吸式昆虫取食的重要实验方法，是因为EPG的波谱与昆虫的刺探行为、唾液分泌、取食等生理过程相对应，可以通过对EPG波谱的分析认识昆虫的取食过程，分析为害原因、传毒机理等等。表1蚜虫类刺吸式昆虫DC-EPG波形的生物学意义(闫凤鸣，2003)TablelBiologicalmeaningsofDC-EPGwaveformsinaphids(YanFM2003)盼段Phase波形Wav-eform刺吸食昆虫行为Insectbehavior口针端部所处植物蛆织和部位Plantlissue(s)wh玲reinsectstylettipreachesA刺探，分泌水溶型唾液表皮刺踩路径阶段B分建凝胶型睡液表皮或叶肉组织Pathwayc刺探叶肉细胞间隙或韧皮部篇分子外部pd细胞内刺探生活细胞内部F口针遇到机械阻力所有蛆织，细胞外部韧皮部阶段El分泌唾液韧皮部筛分子PhloemE2被动吸食韧皮部筛分子木质部阶段（；主动吸食木质部Xykm刺吸式口器昆虫在人工饲料上取食与在植物上取食有很大不同：首先，液体饲囊缺乏植物表面的物理化学环境而且也没有植物内部那么多层次；第二，液体饲囊内只有蔗糖溶液而没有其它营养物质，昆虫的持续取食会受到影响；第三，植物维管束内韧皮部的液体是正压，昆虫是被动吸食，而液体饲囊内的压力有限，昆虫需要调整取食策略，如利用肌肉抽吸等。在人工饲料上的波形与在植物上的波形相似，而且相对于植物来说比较简单，但可以在一定程度上揭示昆虫的取食行为Joostetal.,2006）。人工饲料上的波形一般只有C波、E1波、E2波、Np波。Np（non-probing或non-penetration）波表示昆虫的口针尚未刺穿液体饲囊，基本是一条直线；路径波pathwaywaveforms,包括A、B、C波三种，统称为路径波C波，表示昆虫在吸食之前的刺探行为，代表口针刺破囊膜、鞘唾液分泌及逐渐凝固、水溶性唾液分泌等行为，只是与取食植物相比，在液体饲囊中波形相对较为单一；E1波表示在吸食汁液前水溶性唾液的分泌（类似于在植物韧皮部、筛管中水溶性唾液的分泌）；E2波表示昆虫吸食液体的行为（类似于被动吸食植物韧皮部汁液的行为）；E波是E1、E2波的总和，总体表示昆虫吸食汁液的行为。4小结EPG技术与其它技术的结合，可以很好地阐释昆虫与植物的关系、植物抗性或昆虫传毒机理，而人工饲料又为单一研究某种生物活性物质提供基础，因此，EPG与人工饲料的结合，可以更好地研究某种生物活性成分对刺吸式昆虫的影响。但是在做EPG实验时，要注意一些细节：EPG实验用昆虫标准应该严格保持一致，如：龄期，性别，不同龄期和性别的昆虫有很大的差异；粘连时，银胶应粘在烟粉虱背部，避免粘到头部或翅膀影响昆虫活动；放置昆虫前，要将仪器调试好；昆虫饥饿时间要适宜。参考文献：Douglas,A.E.1998.Nutritionalinteractionsininsect-microbialsymbioses:aphidsandtheirsymbioticbacteriaBuchnera.Annu.Rev.Entomol.43,17-37.FebvayG,DelobelBandRahbeY.1988.InfluenceoftheaminoacidbalanceontheimprovementofanartificialdietforabiotypeofAcyrthosiphonpisum(Homoptera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