基础生物学实验(三)基础生物学实验(安徽大学生物研究生复试,生命科学学院)

基础生物学实验(三)

生物化学

（

2005）孔小卫黄训端安徽大学基础生物实验教学中心二零零五年六月现在是1页\一共有59页\编辑于星期一目录实验一糖类的定量测定实验二纸层析法分析氨基酸实验三血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳实验四酵母RNA的提取及含量测定实验五外界因素对酶活性的影响实验六碘滴定法测定抗坏血酸现在是2页\一共有59页\编辑于星期一实验一糖类的定量测定—3，5-二硝基水杨酸比色定糖法一、实验目的1．掌握3，5一二硝基水杨酸法定糖的原理及方法。2．用3，5一二硝基水杨酸比色法测定山芋粉中总糖。3．熟悉分光光度计的原理及使用方法。二、实验原理

糖类的测定方法有物理方法和化学方法两类。由于化学方法比较准确，常常使用之。还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基和酮基的糖类。现在是3页\一共有59页\编辑于星期一3，5一二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，棕红色物质颜色的深浅程度与还原糖的量成正比。因此，我们可以利用比色法测定样品中还原糖以及总糖的含量。该法是半微量定糖法，操作简便、快速，杂质干扰较少。三、实验操作（一）样品中总糖的水解及提取准确称取山芋粉1g，放入小三角烧瓶中，加入10ml6NHCL和15ml蒸馏水，混匀。在沸水浴加热30min后，用KI-I2溶液检查水解程度。若已水解完全，则不呈现蓝色。冷却后加入酚酞试剂一滴，以10%NaOH中和至溶液呈微红色。过滤并定容至100ml。再精确吸取上述溶液10ml，放入100ml容量瓶，稀释到刻度，备用。（二）葡萄糖标准曲线的制作取7支大试管分别按表1-1顺序加入各种试剂。现在是4页\一共有59页\编辑于星期一表1-1制作葡萄糖标准曲线时各试剂用量项目空白123456含糖总量（mg）00.40.60.81.01.21.4葡萄糖液（ml）00.40.60.81.01.21.4蒸馏水（ml）2.01.61.41.21.00.80.6DNS试剂(m1)1.51.51.51.51.51.51.5加热均在沸水浴中加热5min冷却立即用流动冷水冷却蒸馏水(ml)21.5

21.521.521.521.521.521.5光密度(O.D．520)

现在是5页\一共有59页\编辑于星期一将以上各管溶液混匀后，用分光光度计(520nm)进行比色测定，用空白管溶液调零点，记录光密度值，以葡萄糖浓度为横坐标，光密度为纵坐标，绘制出标准曲线。一大组同学做一个标准曲线（三）样品中含糖量的测定取4支大试管，分别按表1—2加入各种试剂。现在是6页\一共有59页\编辑于星期一表1—2测定样品中含糖量时各试剂的用量项目空白123样品量（ml）01.01.01.0蒸馏水（ml）2.01.01.01.0DNS试剂(m1)1.51.51.51.5加热均在沸水浴中加热5min冷却立即用流动冷水冷却蒸馏水(ml)21.5

21.521.521.5光密度(O.D．520)现在是7页\一共有59页\编辑于星期一将各管混匀后，按制作标准曲线时同样的操作测定各管的光密度，在标准曲线上查出相应的总糖含量，按下述公式计算出山芋粉总糖百分含量。总糖=（水解后还原mg数×样品稀释倍数×100％）/样品重量现在是8页\一共有59页\编辑于星期一四、实验要求1.实验过程中所有的试管要干净，加入各种试剂量要准确。2.试剂不可倒出试剂瓶，用干净的移液管吸取，用后盖好瓶塞，防回原处。3.分光光度计使用：溶液不要倒太多；毛边不要对着透光处；用后用自来水冲洗干净，防回原处。4.移液管使用：有色看外边缘，无色看中间凹处。5.实验室中所有的仪器上面不能放置烧杯、试管、试剂瓶等，以防试剂污染仪器。6.每组同学离开实验室时，须经实验老师检查并同意后，方可离开。7.值日生打扫干净实验室后，方可离开。现在是9页\一共有59页\编辑于星期一

实验二纸层析法分析氨基酸一、实验目的1.掌握纸上层析的一般原理和操作方法。2.了解氨基酸的特征性颜色反应。3.学会分析未知样品的氨基酸成分。二、实验原理

纸上层析法是分配层析法中的一种，常以滤纸为惰性支持物。纸上层析法是分离、鉴定和定量测定氨基酸、糖类、抗生素等有机物质的一项重要而简便的分析方法。所用设备简单、操作方便，使用样品少，分离效果好，为近代生物化学分析中重要技术之一。此法广泛地应用于科研和生产分析工作中。现在是10页\一共有59页\编辑于星期一

纸上层析的原理：常以水和有机溶剂作为展层剂；水和有机溶剂互溶后形成两个相：一个是饱和了有机溶剂后的水相，一个是饱和了水后的有机溶剂相。由于滤纸纤维素上的羟基和水分子有较大的亲和力，而与有机溶剂的亲和力相对较弱，因此我们认为水相为固定相，有机溶剂相为移动相。由于物质的极性大小不同，在两相中分配比例有所差异。极性小的物质在有机相中分配较多，随有机相移动较快；而极性大的物质在水相中分配较多，移动相对较慢，从而将极性不同的物质分开。一般来说，在相同的条件下，每种物质都有其固定的Rf值。Rf值的定义为：Rf=(原点到层析斑点中心的距离)/（原点到溶剂前沿的距离）现在是11页\一共有59页\编辑于星期一影响Rf值的因素有：①物质本身的化学结构；②展层所用溶剂系统；③展层剂pH值；④展层时的温度；⑤展层所用滤纸；⑥展层的方向(横向，上行或下行)。用纸层析鉴定样品时，一般都与标准品相比较。若没有标准品，可选择文献记载的该物质层析条件，根据文献Rf值进行鉴定。现在是12页\一共有59页\编辑于星期一

三、实验操作

1．纸的处理取18cm长、18cm宽的滤纸一张，离底边2cm处用铅笔轻轻划一条与底边平行的线，并等距离的在线上定点样点(原点)划圈，使圈的直径小于0.5cm。2．点样在每个圈下用铅笔记上每种氨基酸的代号（混合样可写M），然后用毛细管吸取样品，轻轻地点到相应的氨基酸圈内，待晾干或用冷风吹干后再点1次。每个样品共点2次。3．层析将点好样的滤纸纵向卷起来，点样面向里，点样点位于一端，用针线缝成筒状，不要使滤纸两边接触(见图1)。将培养皿中放入2／3量的展层剂，放入层析缸中，然后将滤纸直立于层析缸的培养皿中，样品端向下垂直放置，切勿使展层剂浸到样品点，开始层析。当溶剂前沿到达离上端2cm处，取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿，晾干。现在是13页\一共有59页\编辑于星期一图1.滤纸的缝合现在是14页\一共有59页\编辑于星期一4．显色用喷雾器向滤纸上均匀喷洒0.1%茚三酮，晾干后，将滤纸放入烘箱中(80-100℃)，烘烤5分钟后，滤纸上即显出紫红色的氨基酸斑点。用铅笔描出斑点轮廓(见图2)

四.结果处理

用尺量出原点到斑点中心距离以及原点到溶剂前沿距离，计算各标准氨基酸和混合氨基酸的Rf值。现在是15页\一共有59页\编辑于星期一图2.层析谱

1．原点；2．层析点；3．溶剂前沿现在是16页\一共有59页\编辑于星期一五、实验建议(1)在整个操作过程中，手只能接触滤纸边缘，否则手指上的氨基酸会造成滤纸上众多斑点。(2)在点样时，不要将毛细管插错了试剂瓶。(3)展层结束后，切勿忘记用铅笔描出溶剂前沿。(4)点样斑点不能太大（其直径应小于0.5cm），防止氨基酸斑点重复；吹风温度不宜过高，否则斑点变黄。(5)根据目的、要求，选择合适溶剂系统。现在是17页\一共有59页\编辑于星期一实验三血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳一、实验目的1.学习醋酸纤维素薄膜电泳的基本原理。2.了解醋酸纤维素薄膜电泳的操作技术。3.掌握电泳分离血清蛋白质及其定性定量的方法。

二、实验原理醋酸纤维素薄膜电泳是以醋酸纤维素薄膜为支持物的电泳方法。醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯。将它溶于有机溶剂(如丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等)后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状结构，有强渗透性，对分子移动无阻力，厚度为120um。现在是18页\一共有59页\编辑于星期一二、实验原理本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种血清蛋白。血清中含有清蛋白、a一球蛋白、β一球蛋白、γ一球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、分子量、等电点及形状不同，在电场中迁移速度不同。分子量小、等电点低，在相同碱性pH缓冲体系中，带负电荷多的蛋白质颗粒在电场中迁移速度快。例如，以醋酸纤维薄膜为支持物，正常人血清在pH8．6的缓冲体系中电泳1h左右，染色后可显示5条区带。清蛋白泳动最快，其余依次为α1-、α2-、β-、γ-球蛋白。这些区带经洗脱后可用分光光度法定量，也可直接进行光吸收扫描，自动绘出区带吸收峰及相对百分比，临床医学常用它们间相对百分比的改变或异常区带的出现作为临床鉴别诊断的依据。

现在是19页\一共有59页\编辑于星期一三、实验操作（一）仪器与薄膜的准备1.醋酸纤维素薄膜的润湿与选择2.电泳槽的准备在两个电极槽中，各倒人等体积的电极缓冲液，在电泳槽的两个膜支架上各放两层滤纸条，使滤纸一端的长边与支架前沿对齐，另一端浸入电极缓冲液内。当滤纸条全部润湿后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱逐气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上。滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维素薄膜的桥梁，故称为滤纸桥。3.电极槽的平衡现在是20页\一共有59页\编辑于星期一（二）点样用竹夹子取出薄膜，将无光泽面向上平放在滤纸上。点样区距阴极端1.5cm处，点样时，先用玻璃棒取血清，均匀涂在点样器表面(该点样器是由载玻片一端磨成具有斜面而成}，再将点样器轻轻印在点样区内，如图所示，使血清完全渗透至薄膜内，形成一定宽度、粗细均匀的直线。此步是实验的关键，是获得具有清晰区带的电泳图谱的重要环节。

现在是21页\一共有59页\编辑于星期一图11—2

醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图虚线处为点样位置现在是22页\一共有59页\编辑于星期一（三）电泳先恒流，后恒压用竹夹子将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上(点样面朝下)、另一端平贴在阳极端支架上(如图所示)。要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。如一电泳槽中同时安放几张薄膜，则薄膜之间应相隔几毫米。盖上电泳槽盖，使薄膜平衡10min。用导线将电泳槽的正、负极与电泳仪的正、负极分别连接，注意不要接错，在室温下电泳，打开电源开关，用电泳仪上细调节旋钮调到每厘米膜宽电流强度为0.3mA（8片薄膜则为4.8mA）通电10～15min，将电压调节到90～110V，电泳时间50～60min。电泳后调节旋钮电流为O，关闭电泳仪切断电源。现在是23页\一共有59页\编辑于星期一血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳一、实验目的1.学习醋酸纤维素薄膜电泳的基本原理。2.了解醋酸纤维素薄膜电泳的操作技术。3.掌握电泳分离血清蛋白质及其定性定量的方法。

二、实验原理

醋酸纤维素薄膜电泳是以醋酸纤维素薄膜为支持物的电泳方法。醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯。将它溶于有机溶剂(如丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等)后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状结构，有强渗透性，对分子移动无阻力，厚度为120um。

现在是24页\一共有59页\编辑于星期一作为区带电泳的支持物进行蛋白电泳，它具有微量、快速、简便、分辨力高、对样品无拖尾和吸附现象等优点，该技术已广泛应用于血清蛋白、血红蛋白、糖蛋白、脂蛋白、结合球蛋白、同功酶的分离和测定等方面。本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种血清蛋白。血清中含有清蛋白、a一球蛋白、β一球蛋白、γ一球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、分子量、等电点及形状不同(见表1)，在电场中迁移速度不同。分子量小、等电点低，在相同碱性pH缓冲体系中，带负电荷多的蛋白质颗粒在电场中迁移速度快。

现在是25页\一共有59页\编辑于星期一图ll一1正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图1为清蛋白；2，3，4，5分别为α1-，α2-，β-及γ-球蛋白；6为点样原点

此法由于操作简单快速、分辨率高及重复性好等优点，目前已成为临床生化检验的常规操作之一。它不仅可用于分离血清蛋白，还可用于分离脂蛋白、血红蛋白及同工酶的分离测定。现在是26页\一共有59页\编辑于星期一三、实验操作

（一）仪器与薄膜的准备1.醋酸纤维素薄膜的润湿与选择用竹夹子取一片薄膜，小心平放在盛有缓冲液的平皿中。若漂浮于液面的薄膜在15～30s内迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则此膜均匀可用于电泳；若薄膜润湿缓慢，色泽深浅不一或有条纹及斑点，则表示薄膜厚薄不均匀应弃去，以免影响电泳结果。浸泡于缓冲液中约30min，当完全浸透后，用镊子轻轻取出，夹在两层滤纸内吸去多余液体，用于电泳。

现在是27页\一共有59页\编辑于星期一

2.电泳槽的准备根据电泳槽膜支架的宽度，剪裁尺寸合适的滤纸条。在两个电极槽中，各倒人等体积的电极缓冲液，在电泳槽的两个膜支架上各放两层滤纸条，使滤纸一端的长边与支架前沿对齐，另一端浸入电极缓冲液内。当滤纸条全部润湿后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱逐气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上。滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维素薄膜的桥梁，故称为滤纸桥。

3.电极槽的平衡用平衡装置(或自制平衡管)连接两个电极槽，使两个电极槽内的缓冲液彼此处于同一水平状态，一般需平衡15～20min。注意，取出平衡装置时应将活塞关紧。

现在是28页\一共有59页\编辑于星期一（二）点样1.制备点样模板取一张干净滤纸(10cm×10cm)，在距纸边1.5cm处用铅笔划一平行线，此线为点样标志区。2.点样用竹夹子取出薄膜，将无光泽面向上平放在滤纸上。点样区距阴极端1.5cm处，点样时，先用玻璃棒或血色素吸管取2～3ml血清，均匀涂在点样器表面(该点样器是由载玻片一端磨成具有斜面而成}，再将点样器轻轻印在点样区内，如图2所示，使血清完全渗透至薄膜内，形成一定宽度、粗细均匀的直线。此步是实验的关键，点样前应在滤纸上反复练习，掌握点样技术后再正式点样是获得具有清晰区带的电泳图谱的重要环节。

现在是29页\一共有59页\编辑于星期一（三）电泳用竹夹子将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上(点样面朝下)、另一端平贴在阳极端支架上(如图3所示)。要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。如一电泳槽中同时安放几张薄膜，则薄膜之间应相隔几毫米。盖上电泳槽盖，使薄膜平衡10min。用导线将电泳槽的正、负极与电泳仪的正、负极分别连接，注意不要接错，在室温下电泳，打开电源开关，用电泳仪上细调节旋钮调到每厘米膜宽电流强度为0.3mA（8片薄膜则为4.8mA）通电10～15min，将电压调节到90～110V，电泳时间50～60min。电泳后调节旋钮电流为O，关闭电泳仪切断电源。现在是30页\一共有59页\编辑于星期一

（四）染色和漂洗电泳完毕立即取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5min，然后取出，先用自来水冲洗，再用漂洗液漂洗，连续更换3次漂洗液，可使颜色脱去，得到色带清晰的电泳图谱。

（五）透明将脱色吹干后的薄膜浸入透明甲液中2min，取出立即放入透明乙液中浸泡1min，取出后立即紧贴于干净玻璃板上，两者间不能有气泡。5～10min薄膜完全透明。若透明太慢可用透明乙液少许在薄膜表面淋洗一次，垂直放置，待其自然干燥或用吹风机冷风吹干且无酸味，再将玻璃板放在流动的自来水下冲洗，当薄膜完全润湿后用单面刀片撬开薄膜的一角，用手轻轻将透明的薄膜取下，用滤纸吸干所有的水分，最后将薄膜置液体石蜡中浸泡3min，再用滤纸吸干液体石蜡，压干。此薄膜透明，区带着色清晰，可用于光吸收计扫描。长期保存不褪色。现在是31页\一共有59页\编辑于星期一（五）透明将脱色吹干后的薄膜浸入透明甲液中2min，取出立即放入透明乙液中浸泡1min，取出后立即紧贴于干净玻璃板上，两者间不能有气泡。5～10min薄膜完全透明。若透明太慢可用透明乙液少许在薄膜表面淋洗一次，垂直放置，待其自然干燥或用吹风机冷风吹干且无酸味，再将玻璃板放在流动的自来水下冲洗，当薄膜完全润湿后用单面刀片撬开薄膜的一角，用手轻轻将透明的薄膜取下，用滤纸吸干所有的水分，压干。此薄膜透明，区带着色清晰，可用于光吸收计扫描。长期保存不褪色。现在是32页\一共有59页\编辑于星期一五、实验建议(1)醋酸纤维素薄膜的预处理市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。为防止指纹污染，取膜时应戴指套或用夹子。所选薄膜应厚薄均匀，否则应弃去不用，以免造成电泳区带扭曲，界线不清，背景脱色困难，结果难以重复。由于薄膜吸水性比纸小，浸泡30min以上是保证膜片上有一定量缓冲液，并使其恢复到原来多孔的网状结构，最好让薄膜吸满缓冲液后自然下沉，这样可将膜片上聚集的小泡赶走。点样时薄膜上的缓冲液不宜太多，但也不能太干。(2)缓冲液的选择本实验常用的pH8．6巴比妥缓冲液，其浓度为0．05～O．09mol／L。选用何种浓度与样品及薄膜的厚薄有关。缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快，并由于扩散变宽；缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，区带分布过于集中，不易分辨。现在是33页\一共有59页\编辑于星期一(3)加样量加样品量的多少与电泳条件、样品性质、染色方法与检测手段灵敏度密切相关。作为一般原则，检测方法越灵敏，加样量越少，对分离更有利。如加样量过大，则电泳后区带分离不清楚，甚至相互干扰，染色也较费时。点样好坏是获得理想图谱的重要环节之一，以印章法加样时，动作应轻、稳，用力不能太重，以免将薄膜弄破或印出凹陷而影响电泳区带分离效果。(4)电量选择电泳过程应选用合适的电流强度，一般为0.3～0．5mA／cm宽膜。电流强度高，则热效应高，可能引起蛋白质变性或由于缓冲液蒸发造成膜片干涸。电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散。(5)染色液的选择染色液应根据样品的特点加以选择。其原则是染料对被分离样品有强的着色力，背景易脱色，应尽量采用水溶性染料，不宜选择醇溶性染料，以免使薄膜溶解。

现在是34页\一共有59页\编辑于星期一应控制染色时间。时间太长，薄膜底色深不易脱去；时间太短，着色浅不易区分，或造成染色不均匀，必要时可进行复染。(6)透明及保存透明液应临用前配制，以免冰乙酸和乙醇挥发而影响透明效果。这些试剂最好选用分析纯。透明前薄膜应完全干燥。透明时间应掌握好。如在透明乙液中浸泡时间太长则薄膜溶解，太短则透明度不佳。透明后的薄膜完全干燥后才能浸入液体石蜡中，使薄膜软化。如有水，则液体石蜡不易浸入，薄膜不易展平。现在是35页\一共有59页\编辑于星期一六、实验报告及作业1．根据人血清中血清蛋白各组分等电点，如何估计它们在pH8．6的巴比妥一巴比妥钠电极缓冲液中移动的相对位置?2.简述醋酸纤维素薄膜电泳原理及优点。3.绘出酸纤维素薄膜电泳结果。4.造成电泳图谱不整齐的原因有哪些？现在是36页\一共有59页\编辑于星期一实验四酵母RNA的提取及含量测定

一、实验目的1.掌握RNA提取的原理及方法。2.学会使用地衣酚法测定RNA的含量。二、实验原理

一般的生物细胞中同时含有DNA和RNA，在酵母中RNA比DNA的含量高得多，DNA则少于2％(O．03％～O．516％)，故在实验室常用酵母作为RNA提取的材料。若要制备具有生物活性的RNA，常用苯酚法；若对生物活性没有要求，则可使用浓盐法，稀碱法等。现在是37页\一共有59页\编辑于星期一

从化学组成来说，RNA由碱基、磷酸和戊糖组成。在酸性条件下，戊糖转化成糠醛，其可与地衣酚生成绿色复合物，反应如下：

这种复合物在670nm波长处有最大光吸收。当RNA的浓度于10～100ug／ml范围内，其浓度与光密度值成线性关系。样品中少量脱氧核糖核酸(DNA)存在对测定无干扰，蛋白质、粘多糖也干扰测定。

现在是38页\一共有59页\编辑于星期一本实验采用的稀碱，既可加速细胞的破裂，又可增大RNA的溶解度。当碱被中和后，可用乙醇将RNA沉淀，此为RNA的粗品。现在是39页\一共有59页\编辑于星期一三、实验操作(一)RNA的提取称5g干酵母粉于150ml三角烧瓶中，加30mlO.2％的NaOH，沸水浴中搅拌提取30min。冷却后滴加乙酸使其略偏酸性。离心(4000r／min，15min)，去除沉淀。向上清液中加入30ml95％乙醇，稍搅拌后静置。待完全沉淀后离心(4000r／min，15min)，去上清液。沉淀加10ml95％乙醇，搅拌后再次离心。沉淀再依次用10ml的无水乙醇、乙醚(×2)洗涤。称重，计算RNA的初步得率（a)。(二)RNA的鉴定取沉淀约O.2g，加2ml10％H2SO4→沸水浴中加热2min→加1.5ml地衣酚试剂→沸水浴中加热→观察颜色变化。现在是40页\一共有59页\编辑于星期一(三)地衣酚法测定RNA含量1．标准曲线的制作取6支试管，按下表1编号及加入试剂。表l.制作RNA标准曲线时各试剂用量试剂(m1)

012345RNA标准液

00.40.81.21.62.0蒸馏水

2.01.61.20.80.40地衣酚试剂

2.02.02.02.02.02.0现在是41页\一共有59页\编辑于星期一试剂加完后，摇匀，置沸水浴中煮45min。冷却后，在670nm波长处测各管光密度值。以光密度为纵坐标，每管标准液ml数为横坐标，绘制标准曲线。

2．样品中RNA的测定将(一)中制备的RNA粗品，按标准RNA液的溶解方法溶解，并配成200ug／ml的样品液。取2支试管，分别加入1．Oml和2．Oml样品液，用水补足至2.0ml后，各加2.0ml地衣酚试剂。余步按标准曲线制作方法。测得光密度值后，折算成1.Oml样品液光密度值，并计算其平均值。现在是42页\一共有59页\编辑于星期一四、计算根据所测得平均光密度值，在标准曲线上找出相应的标准RNA溶液ml数(b)，可通过下式计算酵母中RNA的含量。酵母中RNA含量=b×100×a×100％/200五、实验建议(1)戊糖或含戊糖的物质对本法有干扰。(2)因不同时期酵母RNA含量有所变化，若样品光密度值均不在标准曲线范围，可减少加样品液量或增加RNA粗品溶液的浓度。现在是43页\一共有59页\编辑于星期一实验五外界因素对酶活性的影响

一、实验目的1.了解外界因素对酶活性及酶促反应速度的影响。2.加深对酶特性的认识。

二、实验原理酶的化学本质是蛋白质，它极易受外界条件的影响而改变它的构象及性质，因而也必然会影响到它的催化活性。酶对温度、pH、酶浓度及某些离子浓度等变化很敏感。现在是44页\一共有59页\编辑于星期一(一)pH值对酶活性的影响酶的活性受环境pH的影响极为显著，通常各种酶只有在一定的pH范围内才能表现出它的活性。一种酶表现其最高活性时的pH值称为该酶的最适pH。高于或低于最适pH值时，酶的活性降低。酶的最适pH值受酶的纯度、底物的种类和浓度、缓冲液的种类和浓度以及环境温度等条件影响。(二)温度对酶活性的影响每种酶都有其最适温度，高于或低于此温度酶的活性都降低。一般而言，若酶处于过高的温度环境中，会使酶活性永久地丧失；而若处于极低温度的环境中只会使酶活性受到抑制，一旦温度适宜，酶又会全部或部分地恢复其活性。现在是45页\一共有59页\编辑于星期一(三)酶浓度对酶促反应速度的影响在其它条件不变的情况下，若反应物浓度大大高于酶浓度时，则反应速度随酶浓度增加而增加，两者间成正比关系，即：V=k[E]但若反应底物浓度较低，而且酶的浓度足够高时，增加酶浓度，反应速度基本不变。(四)离子对酶活性的影响就唾液淀粉酶而言，低浓度Cl一可以增加酶活性，高浓度的Cl一或者低浓度的Cu2+则会抑制酶的活性，而低浓度的Na+、SO42-等对酶活性没有影响。不同的酶对不同的离子具有不同的效应。现在是46页\一共有59页\编辑于星期一

四、实验操作(一)pH对酶活性的影响1．缓冲溶液的配制取6只洁净的三角烧瓶，按表1编号和加试剂：

表1.磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲溶液的配制三角烧瓶号123456pH值5.46.26.87.07.48.00.2mol／L磷酸氢二钠(m1)11.15

0.1mol／L柠檬酸(m1)8.85

现在是47页\一共有59页\编辑于星期一2.取6支洁净试管，分别编号后，按表2操作：表2pH对酶活性的影响管号

123456pH值

5.46.26.87.07.48.0缓冲液量(m1)

333333含NaCl的0.5％淀粉(m1)

222222稀释100倍唾液(m1)

222222充分摇匀

37℃保温，lmin后，用滴管从3#管中吸l滴反应液，放白瓷板用碘液检验(1滴)。以后每隔1min检验一次。当3#管反应液遇碘液呈淡黄色时，立即向6支管中加碘液

碘液(滴)

222221充分摇匀实验结果

现在是48页\一共有59页\编辑于星期一(二)温度对酶活性的影响取3支洁净试管，按表3操作：

表3温度对酶活性的影响管号

123pH6.8磷酸缓冲液(m1)

222含NaCl的O.5％淀粉液(m1)

222稀唾液1：50(m1)111立即处理温度0℃100℃37

℃

放置15min分别从l、2、3支试管中取出一滴在白瓷板上用碘液检验结果

改变处理温度至

37℃37℃37℃作用时间

15min再分别从1、2、3管中取出一滴在白瓷板上用碘液检验结果

现在是49页\一共有59页\编辑于星期一(三)酶浓度对酶活性的影响1．取3支洁净试管，编号，按表4加入淀粉液，缓冲液，加毕后放人37℃恒温水浴中保温5min。表4酶浓度对酶活性的影响

管号

含NaCl的O．5％淀粉液

pH6.8的缓冲液

稀释唾液

褪色时间

105010013ml

2ml

1ml23ml

2ml1ml33ml

2ml1ml现在是50页\一共有59页\编辑于星期一2．保温后，快速加不同浓度的稀释唾液，摇匀，立即放入37℃恒温水浴中。计时，并每隔1min从各管中取出1滴，用碘液检验，记录从加进酶液至碘液检验为橙黄色所需时间。现在是51页\一共有59页\编辑于星期一(四)离子对酶活性的影响取3支洁净试管，编号后按表5操作：表5离子对酶活性的影响管号

1231％NaCl(m1)