类型与特点简介

类型与特点简介第1页/共63页第一节透射式电镜第三节扫描透射式电镜第四节分析类电镜第五节扫描探针式显微镜第二节扫描式电镜第六节激光共聚焦显微镜第2页/共63页第一节透射式电子显微镜一般（常规）TEM：100KV高压TEM：200KV超高压TEM：500Kv、1MV、3MV根据加速电压的大小分为：第3页/共63页一、常规透射电镜（TEM）1、原理：主要利用入射电子束穿过样品，产生携带样品横截面内部的电子信号，并经多级磁透镜的放大后成像于荧光板，整幅像同时成立。2、特点：

⑴样品超薄h<1000Å⑵二维平面像、立体感差⑶分辨率高，优于2Å⑷样品制备复杂3、观察对象：

主要样品内部超微结构（可用来观察组织和细胞内部的超微结构、微生物、生物大分子等）第4页/共63页第5页/共63页第6页/共63页第7页/共63页二、超高压透射电镜（UHVEM:ultra-highvoltageelectronmicroscope）

HV<500kv为常规及高压电镜,一般TEM：100~200KVHV>500kv为超高压电镜，Hvmax=1MV（法），3MV，15MV（美），10MV（日）1、特点：

⑴穿透能力强、可观察较厚的样品µm级⑵分辨率高，2Å（晶格分辨率）⑶单色性好，色差小，成像质量好⑷加速电压越高，散射截面越小，辐射损伤减小⑸场深大，可获取样品的三维结构信息⑹样品室一般为环境样品室，可观察活体生物样品2、缺点：

体积庞大、结构复杂、价格昂贵、需专用的防护装置3、观察对象：主要研究非生物材料的晶格结构、观察细胞骨架系统（微梁、微丝），人工培养细胞、血细胞等第8页/共63页日立超高压电镜H-3000（3MV）第9页/共63页第二节扫描式电镜依据性能不同主要分为：（1）常规（一般）SEM（2）环境扫描电镜（3）低压扫描电镜（4）场发射电子枪SEM（5）生物用SEM（6）扫描电－声电镜第10页/共63页

1、原理：

利用电子束轰击样品表面，引起二次电子等信号的发射，主要利用SE并放大、传递SE所携带的信息，按时间序列逐点成像，显像管上成像2、特点：

⑴图象立体感强、可观察一定厚度的样

⑵样品制备简单，可观察较大的样

⑶

分辨率较高，30~40Å

一、常规扫描电镜（SEM）第11页/共63页2、特点：

⑷倍率连续可变，从4倍~~15万⑸可配附件，进行微区的定量、定性分析3、观察对象：

主要用于观察样品的表面形貌、割裂面结构，管腔内表面的结构等第12页/共63页1、特点：①多种真空状态：高、低、超低真空

1Torr（乇）=1mmHg柱压力=1/760标准大气压=133.3Pa

粗真空：760~10乇低真空：10~10-3乇 高真空：10-3~10-8乇超高真空：10-8乇以下多种真空条件下可得SEI像、BEI像，且

=4nm②样品室可充气体:水气、氮气

③动态分析：样品温度从-185℃~1000℃④制样简单：样品无须镀膜、脱水、干燥等处理真正的“环境”条件，可直接观察含水、含油样品低气压空间二、环境扫描电镜（ESEM）第13页/共63页2、缺点：

造价太高$30万，Philips（FEI），分辨率仍不很高3、观察对象：

活体生物、真菌、细菌、人工培养细胞等（含液体［水或油等］、以及不适合进行常规固定、脱水、干燥等处理的样品）如：ESEM最适宜观察培养基上人工培养细胞的表面微观结构。第14页/共63页三、低压扫描电镜（LVSEM:lowvoltage）2、特点

⑴加速电压降低，增强反差⑵试样不易发生充放电效应，

⑶Hv=2－3Kv时也可获得1nm的分辨率3、观察对象：

可观察绝缘物质、生物样品、半导体材料1、类型：⑴高分辨型低压扫描电镜⑵新型“减速”低压扫描电镜第15页/共63页四、场发射电子枪SEM场发射电子枪SEM优点:

⑴场发射电子枪具有亮度高、能量分散少，阴极源尺寸小等优点，其分辨率已达到0.3-0.4nm。⑵可在低加速电压下进行高分辨率观察，因此可以直接观察绝缘体而不发生充、放电现象。第16页/共63页优点：装备有冰冻、冷热样品台，可把含水生物样品迅速冷冻并对冰冻样品进行观察，可以减少化学处理引起的人为变化，使观察样品更接近于自然状态。若要观察内部结构，还可用冷刀把样品进行切开，加温使冰升华，并在其上喷镀一层金属再进行观察，所有这些过程都在SEM中不破坏真空的状态下进行。五、生物用SEM第17页/共63页六扫描电－声电镜SEAM（ScanningElectronAcousticMicroscope）成像原理基于样品微热学和弹性性质的变化建立图像的，优点如下：1.电子束斑直径小10nm，分辨率高2.能交换显示同一样品的二次电子像和扫描电－－声像。3.能显示样品表面和亚表面不同层次的图像，并且不破坏成像的剖面。4.节省费用，对现有的SEM稍加改装即可一机两用(一)优点：比较振幅和相位的成像结果，可以区别表面和亚表面的结构差异。第18页/共63页（二）扫描电－声显微镜的成像原理成像过程及原理框图第19页/共63页第20页/共63页(三)SEAM观察的对象：

可以显示样品表面或表面下不同层次的微观热性质的差异，适宜检测有晶格结构或有分层结构的金属、陶瓷、半导体材料、有机介质等样品，进行生物样品表面和亚表面分析，进行晶体界面分析和亚表面无损分析。如：生物组织、大分子结构的分层研究和检测，组织损伤研究等。

第21页/共63页1.超高真空的场发射式STEM第三节扫描透射式电镜（STEM）

2.附件型STEM

工作原理介于TEM与SEM之间，兼顾SEM及TEM的优点、功能更强大、又弥补各自的缺点。（一）类型

使用场发射电子枪，单晶钨针尖灯丝，可以获得很高的亮度10－8－10－10A/cm2立体弧度，分辨率0.3-0.5nm，真空度10－10torr，价格极高。附件附加在TEM或SEM上，分辨率较低，TEM电镜附件型分辨率1－1.5nm;SEM电镜附件型分辨率4－6nm,附件型STEM主要用于X－ray能谱、波谱分析或电子损失谱分析，用以观察元素分布图第22页/共63页⑴兼顾SEM及TEM的特点、功能强大、但造价高⑵分辨率不如TEM高,高分辨型0.3~0.5nm;附件型1~1.5nm⑶在200KV以上且超高真空时，照射面积小，热损伤和辐射损伤小、污染小，可以观察到铀和钍原子像⑷能过检测到扫描透射电子、透射电子和散射电子，并可同时观察明场和暗场，可进行适当的处理和比较，获取更多超微结构信息⑸可观察较厚样品(0.2~0.4µm)和低反差样品，图像的反差和亮度易调节，切片可以不染色⑹显像方式：荧光板、显像管（二）、特点（三）、观察对象：观察样品表面、内部，获取样品的明场及暗场图像第23页/共63页第四节分析类电镜分析电镜是利用电子束（射线）轰击样品所产生的X射线或俄歇电子等信号对样品元素进行分析的一类电镜。其基本特点：能在观察超微结构的同时，对样品中一个极微小的区域进行化学分析，从而在超微结构水平上测定各种细胞结构的化学成分及其变化规律。第24页/共63页（1）分析TEM：

也称生物分析电镜（BATEM:biologicanalysis）

TEM+EDS（or：WDS），分辨率高

=1.5Å、分析性能好。目前很多100KV和200KVTEM都可以装上X射线检测附件，进行样品的元素分析。（2）分析SEM：

在SEM上配备X射线能谱仪（或波谱仪）后，便可兼有电子探针分析样品化学成分的功能。（3）扫描俄歇电镜：

把SEM与俄歇电子能量分析仪相结合，即成为扫描俄歇电镜，它能对样品表面进行微区元素分析，是一种表面微观分析电镜。（一）分析电镜的类型第25页/共63页（AEM:analysiselectronmicroscope)

连续X-ray背底扣除能量：Z特征X-ray的能量特征X-ray

波长：Z特征X-ray的波长1、波谱仪（WDS）

Wavelength-dispersespectrometer

微区定量分析，4Be92U慢20~60分，灵敏度高2、能谱仪（EDS）

Energy-dispersespectrometer

微区定性分析，11Na92U快2~3分，灵敏度低（二）分析电镜的原理第26页/共63页连续X-ray特征X-ray第27页/共63页波长与能量之间的关系：特征X射线的波长与加速电压无关系，只与样品的种类有关系。

特征X-ray的波长和能量随样品中各元素的不同而异，可用于定量、定性分析

Z↗激发的特征X-ray能量E↗波长↘即：只要是同一种原子，不论其所处的物理或化学状态如何，它们所发出的特征X射线均应具有相同的波长或能量。分析电镜中X射线显微分析的理论依据：第28页/共63页第五节扫描探针式显微镜（1）扫描隧道显微镜（STM）（2）原子力显微镜（AFM）（3）激光力显微镜（LFM）、（4）扫描电化学显微镜（SECM）分类：第29页/共63页一、扫描隧道显微镜（STM）（STM:scanningtunnelingmicroscope）1、原理：利用量子隧道效应获取样品表面结构。其关键部件是有一个加上一定电压的精密探针，当探针接近物质时，由于‘隧道效应’而有电子飞出，从而在探针与物质之间有电流通过。第30页/共63页当探针沿物质表面扫描时，使探针与物质表面间的距离不断发生改变，从而引起电流不断发生改变。将电流的这种改变图象化，即可显示出原子水平的凹凸形形态。第31页/共63页第32页/共63页2、STM特点：⑴M=1000万倍，水平<1Å，垂直<0.1Å⑵可进行“活体”观察、可在大气、液体环境下直接观察物质表面特征⑶三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。⑷（观察固体时）只能观察导体和半导体的表面结构、非导电的物质需要覆盖一层导电薄膜3、STM应用：主要用于研究表面科学、半导体材料、生命科学第33页/共63页优点：可在真空、大气、常温等不同环境下工作，甚至可将样品浸在水和其它溶液中，不需要特别的制样技术，并且探测过程对样品无损伤。这些特点适用于研究生物样品和在不同试验条件下对样品表面的评价，例如对于多相催化机理、超导机制、电化学反应过程中电极表面变化的监测等。STM在生物领域的应用：

STM在生物和有机材料一领域有着广泛的应用前景。尽管目前还存在着如何解释生物样品的STM图象、如何更好地制备生物样品以及选择合适衬底以沉积生物分子等问题，但实际应用中已取得了不少好结果。例如在真空、大气和溶液条件下的DNA研究，球蛋白、胶原蛋白及红血球的研究等。扫描隧道显微镜能直接观察生物大分子(如DNA、RNA和蛋白质等)的原子布阵，也能观察一些生物结构(如生物膜、细胞壁等)的原子排列。在生物学研究中发挥着重要作用，将把生物学研究推进到纳米科学水平。第34页/共63页STM在纳米科技中的应用：

STM不仅能够对样品表面进行成像，而且还能在纳米尺度上对材料表面进行刻蚀与修饰。由微观到宏观，即直接操纵单个原子和分子，对它们进行排列组合，以形成新的物质，或制造出一定功能的机器这是实现纳米加工的新思想，STM的出现使这一思想变为现实。自从STM问世以来，STM作为一种纳米加工的工具的研究已涉及到表面直接刻写、电子束诱导沉积以及单原子操纵等方面，并取得了一批高水平的研究结果。第35页/共63页扫描隧道电子显微镜下金原子的晶格排列图像第一节形态观察技术第36页/共63页硅111面7×7原子重构象

硅片是大家熟悉的制作晶体管和大规模集成电路的半导体材料，为了得到表面清洁的单质材料，要对硅片进行高温加热和退火处理，在加热和退火处理的过程中硅表面的原子进行重新组合，结构发生较大变化，这就是所谓的重构。

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1990年，IBM公司的科学家展示了一项令世人瞠目结舌的成果，他们在金属镍表面用35个惰性气体氙原子组成“IBM”三个英文字母。第38页/共63页科学家把碳60分子每十个一组放在铜的表面组成了世界上最小的算盘。与普通算盘不同的是，算珠不是用细杆穿起来，而是沿着铜表面的原子台阶排列的.第39页/共63页这是中国科学院化学所的科技人员利用纳米加工技术在石墨表面通过搬迁碳原子而绘制出的世界上最小的中国地图。第40页/共63页DNA分子拉成的DNA图象第41页/共63页二、原子力显微镜（AFM：atomicforcemicroscope)2、特点：⑴导电样品、非导电样品均可观察⑵分辨率达到原子水平⑶可以在真空、超高真空、电化学环境、常温、低温条件下工作，可以三维成像

3、应用：主要用于表面科学、生命科学、材料科学

注：以STM、AFM为基础，衍生出扫描探针显微镜（SPM：Scanningprobemicroscope）：如激光力显微镜（LFM）、扫描电化学显微镜（SECM）1、原理：通过检测探针与样品表面顶端原子之间的相互作用力（摩擦与排斥力，即原子力）来分析再现固体样品表面形貌结构。第42页/共63页AFM在生命科学中的应用举例：⑴生物大分子的结构、生物分子相互作用前后构型的变化。⑵进行生物分子之间力的测定及操纵调控：在酶与底物的作用力上的应用（用原子力显微技术研究乙酰胆碱与乙酰胆碱酯酶之间的作用力）⑶细胞生物学：研究活体细胞或化学固定的细胞如红细胞、白细胞、细菌、心肌细胞、活肾上皮细胞及神经胶质细胞的动态行为。第43页/共63页第44页/共63页第45页/共63页第六节激光共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜

LSCM：LaserScanningConfocalMicroscope——以激光作为激发光源，采用光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统。共聚焦系统细胞CT

LSCM：荧光显微镜＋激光扫描装置＋激光发生器＋PC图像处理技术第46页/共63页1、共聚焦扫描显微镜的成像原理采用点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。两者的几何尺寸一致，约100-200nm；相对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的透镜，最终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。这样，来自焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。以激光逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，最终在屏幕上合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像。第47页/共63页ConfocalPrinciple第48页/共63页光电倍增管检测针孔光源针孔光源分色镜物镜样本聚集平面共聚焦扫描显微镜光学原理

检测针孔和光源针孔始终聚焦于同一点，使聚焦平面以外被激发的荧光不能进入检测针孔高分辨率的光学切片

激光穿透性强，可对样本进行一定深度光学断层，获得高标准的连续光学切片实现三维重建第49页/共63页第50页/共63页问题：激光扫描共聚焦显微镜观察到的图象为什么比普通的荧光显微镜的清晰度、层次感要强许多？第一：普通荧光显微镜的不足使用荧光物质标记细胞中的特定成分或结构，不仅图像的对比度增强，而且由于许多荧光显微镜的光源使用短波长的紫外光，大大提高了分辩率（δ=0.61λ/NA）。但当所观察的荧光标本稍厚时，普通荧光显微镜不仅接收焦平面上的光量，而且来自焦平面上方或下方的散射荧光也被物镜接收，这些来自焦平面以外的荧光使观察到的图像反差和分辨率大大降低（即焦平面以外的荧光结构模糊、发虚，原因是大多数生物学标本是层次区别的重叠结构）。第51页/共63页第二：LSCM每一幅焦平面图像实际上是标本的光学横切面，这个光学横断面总是有一定厚度的，又称为光学薄片。由于焦点处的光强远大于非焦点处的光强，而且非焦平面光被针孔滤去，因此共聚焦系统的景深近似为零，沿Z轴方向的扫描可以实现光学断层扫描，形成待观察样品聚焦光斑处二维的光学切片。把X-Y平面（焦平面）扫描与Z轴（光轴）扫描相结合，通过累加连续层次的二维图像，经过专门的计算机软件处理，可以获得样品的三维图像,是细胞CT。第52页/共63页观察方式：以荧光为主光源：激光（紫外、可见光、近红外）照明方式：点照明、逐点扫描成像方式：共聚焦、逐点成像输出：实时观测,数字化图像，可以进行图像处理和定量分析2、LSCM的基本性能第53页/共63页⑴对活细胞和组织或细胞切片进行连续扫描，可获得精细的细胞骨架、染色体、细胞器和细胞膜系统的三维图像。⑵分辨率：接近LM理论分辨率200nm，图像清晰度、对比度大大增强，同时具有高灵敏度、杰出样品保护⑶多维图象的获得，如7

维图象(XYZaλIt):

xyt

、xzt

和xt

扫描,时间序列扫描旋转扫描、区域扫描、光谱扫描、同时方便进行图像处理。

⑷细胞内离子荧光标记，单标记或多标记，检测细胞内如pH和钠、钙、镁等离子浓度的比率测定及动态变化。⑸可多重染色观察：可以在同一张样品上进行同时多重物质标记，同时观察⑹

对细胞检测无损伤，精确、可靠和优良重复性；数据图像可及时输出或长期储存。3、LSCM的优点第54页/共63页4、共聚焦扫描显微镜在生命科学研究中的应用⑴

细胞生物学：

如：细胞结构、细胞骨架、细胞膜结构及其流动性、受体、细胞器结构和分布变化、细胞凋亡机制；各种细胞器、结构性蛋白、DNA、RNA、酶和受体分子等细胞特异性结构的含量、组分及分布进行定量分析