酶免疫技术医学宣教专家讲座

第二节酶免疫技术分类一、均相酶免疫测定二、非均相酶免疫测定第三节酶联免疫吸附试验一、基本原理二、方法类型及反应原理思索题小结酶免疫技术医学宣教专家讲座第1页放射免疫技术发光免疫技术酶免疫技术三大经典标识技术三大经典标识技术酶免疫技术医学宣教专家讲座第2页

第一节酶免疫技术特点

酶免疫技术医学宣教专家讲座第3页主要试剂:

酶标识抗体或抗原酶标物特点：

免疫学活性酶对底物催化活性抗原抗体反应特异性+酶高效催化反应专一性原理及特点酶免疫技术医学宣教专家讲座第4页特点：灵敏度高、特异性强、准确性好酶标识试剂能够较长时间保持稳定操作简便、对环境没有污染。易与其它技术偶联衍生出适用范围更广新方法。原理：酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）特异性反应酶对底物显色反应反抗原或抗体进行定位、定性或定量测定分析

原理及特点酶免疫技术医学宣教专家讲座第5页标识酶要求：

活性高性质稳定专一性强酶催化底物显色信号易于判断和测量方法敏感，重复性好，简单易行酶底物易于配制保留，酶及底物价廉

一、酶和酶作用底物酶免疫技术医学宣教专家讲座第6页辣根过氧化物酶（HRP）

糖蛋白（主酶）亚铁血红素（辅基）主酶与酶活性无关辅基是酶活性中心RZ值：403nm（辅基）与275nm（主酶）OD值之比RZ值与酶活性无关，酶活性单位比RZ值更为主要ELISA中应用最为广泛标识用酶惯用酶酶和酶作用底物酶免疫技术医学宣教专家讲座第7页碱性磷酸酶（AP）

菌源性AP肠粘膜AP

β–半乳糖苷酶（β-Gal）

用于均相酶免疫测定

惯用酶酶和酶作用底物酶免疫技术医学宣教专家讲座第8页HRP底物

DH2+H2O2→→→D+2H2O

HRP供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有各种

H2O2为受氢体，HRP对受氢体专一性很高

惯用底物酶和酶作用底物酶免疫技术医学宣教专家讲座第9页HRP常见底物

邻苯二胺OPD四甲基联苯胺TMB5-氨基水杨酸5-ASA2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐ABTS惯用底物酶和酶作用底物酶免疫技术医学宣教专家讲座第10页OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，致癌性。TMB反应后显蓝色，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛底物。

HRP常见底物

酶和酶作用底物酶免疫技术医学宣教专家讲座第11页AP底物

β-Gal底物

对-硝基苯磷酸酯（pNPP）4-甲基伞酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）经AP作用后产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405nm。

酶作用后，生成高强度荧光物，用荧光计测量。惯用底物酶和酶作用底物酶免疫技术医学宣教专家讲座第12页酶免疫技术关键组成部分

酶结合物（conjugate）酶标识物经过化学反应或免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成结合物

二、酶标识抗体或抗原酶免疫技术医学宣教专家讲座第13页抗原要求纯度高，抗原性完整抗体需要特异性好、效价高、亲协力强以及比活性较高，能批量生产，易纯化。

制备方法要求酶标识抗体或抗原酶免疫技术医学宣教专家讲座第14页制备方法要求技术方法简单、产率高，重复性好标识反应不影响酶和抗原或抗体活性酶标识物稳定，不形成聚合物酶标识抗体或抗原酶免疫技术医学宣教专家讲座第15页制备方法过碘酸钠法（直接法）惯用于HRP标识抗体或抗原

戊二醛交联法酶标识抗体或抗原酶免疫技术医学宣教专家讲座第16页戊二醛交联法戊二醛分子中有两个相同醛基，可分别与HRP和蛋白质分子中氨基结合。该法有一步法和二步法。二步法标识效率比一步法高，酶标识物质量较均一。

酶标识抗体或抗原酶免疫技术医学宣教专家讲座第17页纯化及判定标识完成后应除去反应液中游离酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体或抗原聚合物，防止游离酶增加非特异显色，以及游离抗体或抗原起竞争作用而降低特异性染色强度

惯用纯化方法：葡聚糖凝胶G-200/G-150过柱层析纯化50%饱和硫酸铵沉淀提纯酶标识抗体或抗原酶免疫技术医学宣教专家讲座第18页固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合酶标识物快速分离最惯用方法

固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固相载体表面

三、固相载体酶免疫技术医学宣教专家讲座第19页要求

结合抗体或抗原容量大抗体或抗原牢靠地固定在其表面不影响免疫反应性利于反应充分进行固相方法简便易行，快速经济种类塑料制品

微颗粒膜载体

固相载体酶免疫技术医学宣教专家讲座第20页将抗原或抗体结合于固相载体用1%～5%牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清消除固相载体表面未结合位点，消除非特异性吸附包被coating封闭blocking包被与封闭酶免疫技术医学宣教专家讲座第21页

第二节酶免疫技术分类

酶免疫技术医学宣教专家讲座第22页酶免疫技术酶免疫组化酶免疫测定均相非均相固相酶免疫测定液相酶免疫测定组织切片或其它标本中抗原定位

液体标本中抗原或抗体定性和定量酶免疫技术医学宣教专家讲座第23页用于小分子激素和半抗原（如药品）测定

酶标识物与对应抗原或抗体结合后，标识酶活性会发生改变，不用分离结合和游离酶标识物，经过测定标识酶活性改变，而确定抗原或抗体含量。原理一、均相酶免疫测定酶免疫技术医学宣教专家讲座第24页最具代表性两种技术酶放大免疫测定技术EMITenzyme-mutipliedimmunoassaytechnique

克隆酶供体免疫分析

CEDIAclonedenzymedonorimmunoassay

均相酶免疫测定酶免疫技术医学宣教专家讲座第25页EMIT示意图酶免疫技术医学宣教专家讲座第26页CEDIA示意图酶免疫技术医学宣教专家讲座第27页分类：液相酶免疫测定固相酶免疫测定以聚苯乙烯等材料作为固相载体酶联免疫吸附试验（ELISA）是当前最为惯用固相酶免疫测定与均相不一样之处需分离游离与结合酶标识物二、非均相酶免疫测定酶免疫技术医学宣教专家讲座第28页

第三节酶联免疫吸附试验

酶免疫技术医学宣教专家讲座第29页底物显色定性或定量分析原理包被反应加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体洗涤使结合在固相上抗原抗体复合物与未结合分离1234一、基本原理酶免疫技术医学宣教专家讲座第30页固相抗原或抗体

酶标识物（酶结合物）

酶反应底物

三个必要试剂

二、方法类型及反应原理酶免疫技术医学宣教专家讲座第31页双抗体夹心法方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色应用：

二价或二价以上较大分子抗原测定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等ELISA检测抗原方法酶免疫技术医学宣教专家讲座第32页酶免疫技术医学宣教专家讲座第33页1、已知抗体包3、加酶标抗体4、加酶作用的底物2、加待检物4、加酶作用的底物洗涤洗涤洗涤洗涤双抗体夹心法测抗原1、已知抗体包2、加待检物无抗3、加酶标抗体+-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYY酶免疫技术医学宣教专家讲座第34页竞争法

方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。

应用：用于只有一个抗原决定簇小分子半抗原（药品、激素等）ELISA检测抗原方法酶免疫技术医学宣教专家讲座第35页酶免疫技术医学宣教专家讲座第36页洗涤洗涤竞争法测抗原+-YYYYYYEYYEYYYYEYYEYEYEYE2、加待检物抗原与酶标抗原竞争与抗体结合3、加酶作用底物不显色或显色弱3、加酶作用底物显色1、已知抗体包被于载体表面1、已知抗体包被于载体表面2、加待测物和酶标抗原，酶标抗原与抗体结合YE酶免疫技术医学宣教专家讲座第37页间接法方法

用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。优点一个酶标抗抗体检测各种与抗原对应抗体应用

惯用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等测定ELISA检测抗体方法酶免疫技术医学宣教专家讲座第38页酶免疫技术医学宣教专家讲座第39页1、已知抗原吸2、加待检物3、加酶标抗Ig4、加酶作用的底物1、已知抗体吸2、加待检物3、加酶标的抗Ig4、加酶作用的底物洗涤洗涤洗涤洗涤间接法测抗体-YEYYYEYEYYYEYYEYYEYYEYYEYEY+酶免疫技术医学宣教专家讲座第40页双抗原夹心法原理：类似双抗体夹心法操作步骤：类似应用：乙型肝炎表面抗体ELISA检测抗体方法酶免疫技术医学宣教专家讲座第41页竞争法原理：类似检测抗原竞争法

应用：乙型肝炎病毒关键抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)检测ELISA检测抗体方法酶免疫技术医学宣教专家讲座第42页捕捉法

应用：

病原体急性感染诊疗中IgM型抗体

甲型肝炎HAV-IgM抗体

乙型肝炎病毒关键HBc-IgM抗体ELISA检测抗体方法酶免疫技术医学宣教专家讲座第43页捕捉法

原理：抗人IgMμ链抗体包被捕捉待测标本中IgM类抗体加入特异性抗原和酶标识特异性抗原抗体底物显色

酶免疫技术医学宣教专家讲座第44页洗涤洗涤洗涤洗涤捕捉法原理+-EYEYEYEYEYYYYYYY

1、固相化抗人IgMYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY1、固相化抗人IgM2、加待测物特异性IgM与非特异性IgM和抗人IgM结合3、加特异性抗原，与特异性抗体结合4、加酶标抗体与特异性抗原结合，加底物显色2、加待测物只有非特异性IgM和抗人IgM结合3、加特异性抗原，不能与非特异性IgM结合4、加酶标抗体无抗原结合，加底物不显色酶免疫技术医学宣教专家讲座第45页

第四节酶免疫测定应用

酶免疫技术医学宣教专家讲座第46页均相酶免疫测定主要用于药品和小分子物质检测。非均相免疫测定中ELISA应用更为广泛，ELISA广泛用于传染病诊疗，病毒如病毒性肝炎（甲肝抗体、“乙肝三对”、丙肝抗体、丁肝抗体、戊肝抗体）、风疹病毒、疱疹病毒、轮状病毒等；细菌如结核杆菌、幽门螺杆菌等。也用于一些蛋白质检测，如各种免疫球蛋白、补体、肿瘤标志物（甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特异性抗原等）。酶免疫技术医学宣教专家讲座第47页1．酶免疫技术关键点？2．酶联免疫吸附试验原理（ELISA）？3．竞争法在酶联免疫检测应用中原理和应用？4．惯用底物有哪几类？特点？5．惯用酶有哪几类？特点？6．何谓包被与封闭？其作用？7．惯用固相载体种类和特点？8．举例固相酶免疫测定应用原理及影响原因。9．ELISA非特异性干扰有哪些，其机制？10．对酶免疫技术应用评价怎样？思索题酶免疫技术医学宣教专家讲座第48页酶免疫技术