内皮细胞凋亡和抗血管新生治疗专家讲座

内皮细胞凋亡与抗血管新生治疗

中山大学中山医学院

杨霞

yangxia@内皮细胞凋亡和抗血管新生治疗第1页目录凋亡（apoptosis）血管新生（angiogenesis）内皮细胞凋亡与抗血管新生治疗内皮细胞凋亡和抗血管新生治疗第2页apoptosis概述凋亡过程与调控发生机制凋亡与疾病内皮细胞凋亡和抗血管新生治疗第3页(一)细胞凋亡(apoptosis)第一节概述★由体内外原因触发细胞内预存死亡程序而造成细胞死亡过程。apo-ptosis离开落下PCD（programmedcelldeath）内皮细胞凋亡和抗血管新生治疗第4页一.细胞凋亡研究历史1.

凋亡概念形成和形态学研究(1972）

1972年Kerr等在英国癌症杂志发表论文，首次提出细胞凋亡(apoptosis)概念。宣告了对细胞凋亡真正探索开始。2．DNA降解和内源性核酸内切酶参加(1987）3.蛋白质水解酶活化研究(1995)4.细胞膜改变(1997)5.线粒体改变和分子生物学研究(1998-)1)相关基因及调控

2）信号转导

3）各种分子及其相互作用及相互关系

4）疾病机制说明，以及新疗法探索及问世。内皮细胞凋亡和抗血管新生治疗第5页

二.概念

细胞凋亡是能量依赖细胞内死亡程序活化而致细胞自杀，由基因控制细胞自主有序主动死亡过程。

细胞程序性死亡（programmedcelldeath，PCD）

PCD最初是1956年发育生物学中提出概念，是个功效性概念，强调是其分子生物学和生理功效，普通指生理性细胞死亡。描述在一个多细胞生物体中一些细胞死亡是个体发育中一个预定，并受到严格程序控制正常组成部分。细胞凋亡与坏死区分

内皮细胞凋亡和抗血管新生治疗第6页ProgrammedCellDeathinEukaryotes内皮细胞凋亡和抗血管新生治疗第7页(二)细胞凋亡与坏死区分★坏死凋亡1.性质病理性，非特异性,非遗传性生理性或病理性，特异性遗传性2.诱导原因强烈刺激（极端环境），随机发生较弱刺激，非随机发生3.生化特点被动过程，无新蛋白合成，主动过程，有新蛋白合成，不耗能耗能4.形态改变细胞结构全方面溶解、破坏、胞膜及细胞器相对完整细胞肿胀细胞皱缩，核固缩5.DNA电泳弥散性降解，电泳呈均一DNA片段化（180-200bp）

DNA片状电泳呈“梯”状条带6.炎症反应溶酶体破裂，局部炎症反应溶酶体相对完整，局部无炎症反应7.凋亡小体无有8.基因调控无有内皮细胞凋亡和抗血管新生治疗第8页apoptosis概述

确保胚胎发生、器官发育，调整细胞群体

维持内环境稳定

发挥主动防御功效凋亡生理意义凋亡病理意义

器官功效障碍恶性肿瘤发生(三)凋亡意义内皮细胞凋亡和抗血管新生治疗第9页apoptosis概述凋亡过程与调控发生机制凋亡与疾病内皮细胞凋亡和抗血管新生治疗第10页第二节细胞凋亡过程与调控一、凋亡过程二、凋亡时细胞主要改变三、凋亡调控内皮细胞凋亡和抗血管新生治疗第11页apoptosis凋亡过程与调控一、凋亡过程可大致分成4个阶段

凋亡信号转导

凋亡基因激活

凋亡执行

凋亡细胞去除内皮细胞凋亡和抗血管新生治疗第12页信号转导凋亡诱导原因受体cAMPCa2+神经酰胺（第二信使）胞内信号转导路径激活凋亡程序死亡信号开启预定程序凋亡相关基因激活酶合成核酸内切酶激活Caspases激活DNA切割细胞解体凋亡基因激活执行凋亡去除内皮细胞凋亡和抗血管新生治疗第13页apoptosis生化改变凋亡过程与调控二、凋亡时细胞主要改变

形态学改变内皮细胞凋亡和抗血管新生治疗第14页apoptosis（一）凋亡时细胞形态学改变凋亡过程与调控细胞变圆微绒毛消失胞质浓缩空泡化凋亡小体

早期：核染色质高度浓缩凝集在核周围,边集细胞体积缩小中期：胞膜内陷出芽浓缩核裂解膜自行分割致死前期可逆期致死期不可逆期原期：邻近上皮细胞、MΦ、瘤细胞等吞噬凋亡小体内皮细胞凋亡和抗血管新生治疗第15页（二）细胞凋亡生化改变apoptosis凋亡过程与调控1．DNA片段化核酸内切酶切割核小体，形成180～200bp或成倍数几个核小体长短DNA片段细胞凋亡DNA片段化内皮细胞凋亡和抗血管新生治疗第16页2．和凋亡相关两个酶DNaseCaspasesCa2+

、Mg2+Zn2+内源性促凋亡灭活细胞凋亡抑制物（bcl-2）水解细胞蛋白质结构在凋亡级联反应中水解相关活性蛋白内皮细胞凋亡和抗血管新生治疗第17页Caspases种类及其底物新名称旧名底物Caspase-1ICEPro-IL-1β,PKC-δ,actin,pro-cas1,3Caspase-2ICH-1?Caspase-3CPP32/Yama/apopainPARP,Pro-cas6,9,DNA-PKcs,U1-70kDCaspase-4ICErel-Ⅱ/ICH-2Pro-IL-1β，Pro-cas1Caspase-5ICErel-Ⅲ?Caspase-6Mch2PARP,B1/B2,CCaspase-7Mch3／ICE-LAP3/CMH1PARPCaspase-8FLICE/MACH/Mch5PARPCaspase-9ICE-LAP6/Mch6PARPCaspase-10Mch4Pro-cas3,7PARP:poly(ADP-Ribose)polymerase此表摘自T1B5，1997，7：111内皮细胞凋亡和抗血管新生治疗第18页apoptosis凋亡过程与调控信号TNF相关蛋白存活原因缺失化疗药品发育信号Caspases活化因子死亡受体细胞色素C释放Apaf-1FADD起始Caspase效应CaspaseCaspase-3（-6，-7）Caspase8（-10）Caspase-9执行凋亡（裂解凋亡调控因子，裂解看家蛋白，DNA断裂）Caspases活化与级联反应内皮细胞凋亡和抗血管新生治疗第19页apoptosis凋亡相关基因三、凋亡调控凋亡调控凋亡相关原因

凋亡信号转导内皮细胞凋亡和抗血管新生治疗第20页apoptosis细胞因子：IL-2，神经生长因子，IL-6,IL-4凋亡调控（一）凋亡相关原因诱导性原因：激素和生长因子失衡:过多或过少理化原因：射线、高温、强酸、强碱，抗癌药免疫性原因：微生物学原因：细菌、病毒、毒素抑制性原因：一些激素:ACTH，性激素，CSFs，NGF一些癌基因或细胞凋亡相关基因:内皮细胞凋亡和抗血管新生治疗第21页诱导因子细胞类型T细胞抗原受体胸腺细胞Fas/Apo激活胸腺细胞及其它细胞TNF-α

各种细胞细胞毒性T细胞溶解受感染细胞糖皮质激素淋巴细胞DNA损伤各种细胞谷氨酸神经细胞转化生长因子（TGFβ1）肝细胞细菌感染巨噬细胞诱导凋亡原因内皮细胞凋亡和抗血管新生治疗第22页抑制凋亡原因细胞生长因子细胞类型各种细胞因子造血原始干细胞

IL-2T淋巴细胞抗原B细胞

IL-5嗜酸性粒细胞神经生长因子（NGF）神经元血小板源性生长因子（PDGF）胶质细胞雌激素，黄体酮乳腺，子宫平滑肌雄激素前列腺血清表示c-myc纤维母细胞内皮细胞凋亡和抗血管新生治疗第23页apoptosis（二）凋亡信号转导凋亡调控多途性：同一凋亡诱导原因可经过多条信号转导途径触发凋亡多样性：不一样种类细胞有不一样信号转导系统偶联性：死亡信号转导系统与细胞增殖、分化过程中信号转导系统在一些步骤上有交叉、偶联

同一性：不一样凋亡诱导原因可经过同一信号转导路径触发凋亡凋亡诱导原因凋亡信号转导死亡程序激活apoptosis特点：内皮细胞凋亡和抗血管新生治疗第24页凋亡信号转导1.胞内Ca2+信号系统激活钙依赖谷氨酰胺转移酶活化核转录因子，触发凋亡2.cAMP/PKA信号系统cAMP依赖PKA激活，靶蛋白残基磷酸化，蛋白功效改变3.Fas/FasL信号系统Fas是跨膜蛋白，为TNF受体家族，与T细胞上FasL结合，开启凋亡内皮细胞凋亡和抗血管新生治疗第25页Fas诱发凋亡方式：Fas配体＋Fas蛋白+神经鞘磷脂酶(SMase)神经鞘磷脂(SM)神经酰胺(CER)＋蛋白激酶DNA断裂细胞凋亡抗Fas抗体或TNF与Fas蛋白结合＋ICE样Caspase组蛋白降解染色体松弛DNA链舒展酶切位点暴露Fas蛋白激活Ca2+信号系统传递死亡信息内皮细胞凋亡和抗血管新生治疗第26页凋亡信号转导4.神经酰胺（CER）信号系统神经鞘磷脂（SM）神经酰胺（第二信使）电离辐射TNF-αFas抗原GCapoptosisPLA2SMase丝／苏氨酸激酶(EGFR)丝／苏氨酸磷酸酶(CAPP)PKC底物抑制增生各种细胞反应诱导NFkB下调c-myc表示环氧酶机制内皮细胞凋亡和抗血管新生治疗第27页神经酰胺水解鞘氨醇激酶1－磷酸鞘氨醇（SPP）细胞增殖抗凋亡转录因子（AP-1）S期运转所需基因转录＋内皮细胞凋亡和抗血管新生治疗第28页5.二酰甘油／PKC信号系统凋亡信号转导磷脂酰肌醇磷脂酰胆碱PLC二酰甘油（第二信使）PKCβ1apoptosis生长因子受体PTKGsGiTCRPLCPIP2IP3Ca2+DGPKC核内拓扑异构酶Ⅱ磷酸化DNA损伤凋亡离子通道G蛋白磷酸化cAMP增加凋亡内皮细胞凋亡和抗血管新生治疗第29页6.酪氨酸蛋白激酶(PTK)信号系统凋亡信号转导生长因子（NGF，EGF）细胞因子（IL-3）PTK靶蛋白上酪氨酸磷酸化rasraf-1MAPKKMAPK靶蛋白磷酸化细胞分化生长因子或细胞因子撤除apoptosis内皮细胞凋亡和抗血管新生治疗第30页凋亡信号转导内皮细胞凋亡和抗血管新生治疗第31页（三）凋亡相关基因细胞生存抑凋亡凋亡促凋亡BaxICEwtP53EIBIAPBcl-2内皮细胞凋亡和抗血管新生治疗第32页1.Bcl-2抗凋亡能阻抑各种凋亡诱导原因引发细胞凋亡机制：直接抗氧化抑制线粒体释放促凋亡蛋白质抑制促凋亡性调整蛋白Bax,Bak细胞毒作用抑制caspases激活维持细胞钙稳态内皮细胞凋亡和抗血管新生治疗第33页2.P53促凋亡wtP53突变P53功效：在细胞周期G1期发挥检验点作用开启DNA修复机制开启凋亡机制分子警察细胞受损P53表示P16P27表示CDK抑制RbE2FG1SMycjunfos内皮细胞凋亡和抗血管新生治疗第34页3.C-mycBcl-xC-myc一个癌基因诱导细胞增殖有生长因子诱导细胞凋亡无生长因子（转录调整因子）机制：诱导凋亡功效区与促进细胞转化，本身调整区是同一个区域。C-myc表示信号细胞增殖＋第二信号细胞凋亡MAX1(P21),2(p22)MAD/MAX内皮细胞凋亡和抗血管新生治疗第35页Bcl-xBcl-XL抑制细胞凋亡Bcl-Xs促进细胞凋亡（与bcl-2同源）（与bcl-2同源氨基酸少，抑制）内皮细胞凋亡和抗血管新生治疗第36页apoptosis概述凋亡过程与调控发生机制凋亡与疾病内皮细胞凋亡和抗血管新生治疗第37页apoptosis第三节发生机制一、氧化损伤（自由基作用）1、引发DNA损伤，可激活P53基因。2、引发DNA损伤可活化多聚ADP核糖合成酶，引发NAD

快速耗竭，ATP大量消耗，引发细胞凋亡。3、引发脂质过氧化反应，直接造成细胞膜损伤可诱导细胞凋亡，不饱和脂肪酸过氧化产物促凋亡。4、激活核酸内切酶，膜发泡。5、引发细胞膜通透性增高（Ca2+内流增加）和线粒体膜损伤6、活化核转录因子，可加速凋亡相关基因表示。机制：内皮细胞凋亡和抗血管新生治疗第38页apoptosis二、钙稳态失衡发生机制1、激活钙镁依赖性核酸内切酶，降解DNA链2、激活谷氨酰胺转移酶，催化细胞内肽链间酰基转移，使骨架蛋白交联形成，有利于凋亡小体形成。3、激活核转录因子，加速细胞凋亡相关基因转录。4、Ca2+在ATP配合下使DNA舒展，暴露出核小体之间连接区内酶切位点。内皮细胞凋亡和抗血管新生治疗第39页apoptosis三、线粒体损伤发生机制凋亡诱导原因线粒体跨膜电位↓线粒体膜通透性增加

细胞凋亡开启因子释放CytC,Apaf,AIF等释放增强caspase3水解活性活化Dnase激活Caspases细胞凋亡通透性转换孔（PTP）开放核基因编码膜间蛋白快速内皮细胞凋亡和抗血管新生治疗第40页apoptosis概述凋亡过程与调控发生机制凋亡与疾病内皮细胞凋亡和抗血管新生治疗第41页apoptosis不足与过分并存：动脉粥样硬化

(内皮凋亡过分,平滑肌细胞增殖＞凋亡)第四节凋亡与疾病凋亡失调过分：心肌缺血、心力衰竭、神经元退行性疾病（老年痴呆症）、病毒感染等不足：肿瘤、本身免疫病内皮细胞凋亡和抗血管新生治疗第42页一、细胞凋亡不足（一）肿瘤Bcl-2基因表示增加P53异常（突变，缺失）基因转染（二）本身免疫病胚胎期各种组织器官成熟识别本身抗原淋巴细胞凋亡凋亡不足攻击本身组织内皮细胞凋亡和抗血管新生治疗第43页二、细胞凋亡过分（一）心血管疾病1．心肌缺血再灌注损伤机制：氧化应激缺血缺氧使心肌细胞死亡受体上调，Fas/FasL配体信号系统激活缺氧增加P53基因转录，开启凋亡内皮细胞凋亡和抗血管新生治疗第44页2.心力衰竭机制：氧化应激压力或容量负荷过分神经内分泌失调（交感神经，RAAS，TNF，IL-2，NO）缺血缺氧正常心肌凋亡指数0.2%-0.4%心衰时≥35.5%内皮细胞凋亡和抗血管新生治疗第45页（二）神经退行性疾病以特定神经元进行性丧失为病理特征疾病AD，alzhemer’sdiseasePD，Parkinson’sdise