FCM原理及临床应用

流式细胞术(flowcytometryFCM)是利用流式细胞仪对单个生物颗粒(红细胞、白细胞、各类组织细胞、血小板、微生物等)以及人工合成微球的物理和生物学特性进行多参数定量分析，并能对特定细胞群体加以分选的分析技术。流式细胞术的概念现在是1页\一共有44页\编辑于星期日FCM的工作原理

流式细胞仪组成：1.液流系统2.光学系统3.数据处理系统现在是2页\一共有44页\编辑于星期日1.液流系统：由样本和鞘液组成。待测细胞被制备成单个细胞的悬液，经荧光染料标记的McAb染色后置入样品管中，在清洁气体压力下进入流动室形成样本流。在鞘液(sheath)的约束下，通过喷嘴，使其形成单细胞液柱。现在是3页\一共有44页\编辑于星期日FlowCellInjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid现在是4页\一共有44页\编辑于星期日鞘液：辅助样本流能被正常检测的基质液作用：

1.包裹在样本流的周围，使其处于喷嘴中心，以保证检测的精确性；2.防止样本流中的细胞靠近喷孔壁而堵塞喷孔。现在是5页\一共有44页\编辑于星期日2.光学系统：由激发光源、分光镜、光束成形器等组成。激光是较常用的光源,稳定性好、单色性好。检测信号：散射光和荧光信号被收集、处理、转化为数字信号。现在是6页\一共有44页\编辑于星期日InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid现在是7页\一共有44页\编辑于星期日FCM检测信号散射光信号

前向散射光（fowordscatter,FS）：在激光束正前方的检测器，用于检测细胞或其他粒子物体的表面属性，如大小、形状等。反映细胞颗粒的大小。

侧向散射光（sidescatter，SS）：与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器，主要用于检测细胞内部结构属性，可获得细胞内超微结构和颗粒性质的参数。反映颗粒的内部结构复杂程度、表面的光滑程度。荧光信号(反映被染上荧光的细胞数量多少）现在是8页\一共有44页\编辑于星期日现在是9页\一共有44页\编辑于星期日现在是10页\一共有44页\编辑于星期日现在是11页\一共有44页\编辑于星期日现在是12页\一共有44页\编辑于星期日荧光信号每种荧光染料都有特定的激发波长，受激光激发后会产生特定波长的荧光和颜色，如绿色、红色、黄色等。流式细胞仪就是利用不同波长的光学滤片来检测这些特定发射波长的光学信号。荧光信号反映被染上荧光的细胞数量多少。现在是13页\一共有44页\编辑于星期日现在是14页\一共有44页\编辑于星期日3.数据处理系统：主要由计算机及其软件组成。通过检测散射光及荧光信号对实验数据进行分析存储、显示。具有智能化、自动化特点。现在是15页\一共有44页\编辑于星期日现在是16页\一共有44页\编辑于星期日免疫荧光标记直接免疫荧光染色法：选用荧光标记的McAb是直接针对细胞表面抗原特异性标志的单一抗体,如抗CD3-FITC抗体、抗CD4-PE抗体、抗CD8-PeCy5抗体。间接免疫荧光染色法：选用特异性McAb与相应抗原结合后，再用荧光素标记的第二抗体进行染色。双标记或多标记分析：目前使用的流式细胞仪能用一个激光束激发检测三色甚至四色荧光信号。检测时需注意荧光补偿。现在是17页\一共有44页\编辑于星期日常用免疫荧光染料组合现在是18页\一共有44页\编辑于星期日现在是19页\一共有44页\编辑于星期日荧光补偿：每两种荧光信号间不可避免会出现重叠现象，重叠区越大，信号检测的准确性就越差，因此需计算机工作软件进行自动跟踪调节补偿。现在是20页\一共有44页\编辑于星期日

流式细胞仪的基本功能细胞表型分析(包括细胞膜、胞浆内蛋白表达及核膜成份分析DNA含量及细胞周期分析：DNAcontentanalysis，如细胞凋亡检测细胞分选cellsorting自身免疫性疾病相关HLA抗原分析、自身抗体的检测：如用Hep-2细胞检测抗核抗体。现在是21页\一共有44页\编辑于星期日临床免疫学临床血液学临床肿瘤学血栓与止血骨髓和器官移植基础医学研究流式细胞术的临床应用现在是22页\一共有44页\编辑于星期日

FCM在临床免疫学中的应用(1)淋巴细胞亚群分析T细胞：CD3+CD4+(Th)CD8+(Ts/Tc)B细胞：CD19+NK细胞：CD3-CD16+CD56+现在是23页\一共有44页\编辑于星期日(2)淋巴细胞亚群细分T细胞：Ts：CD8+CD28-Tc：CD8+CD28+Th：CD4+CD29+

B细胞：B1：CD5+CD19-B2：CD5+

CD19+现在是24页\一共有44页\编辑于星期日根据T淋巴细胞分泌细胞因子的不同还可将CD4+、CD8+分为

CD4+:Th1:CD4+IFN-r+Th2:CD4+IL4+Th0:CD4+IFN-r+IL4+

CD8+:Tc1:CD8+IFN-r+Tc2:CD8+IL4+Tc0:CD8+IFN-r+IL4+现在是25页\一共有44页\编辑于星期日辅助性T细胞亚群的生物学功能及临床意义Th1细胞：介导细胞免疫、细胞毒性T细胞的生长和活化、巨噬细胞的活化、介导迟发型过敏反应。其功能亢进将导致炎症慢性迁延，器官特异性自身免疫病，急性排异反应和接触性皮炎等的发病和免疫病理损伤。Th2细胞：介导体液免疫，促进B细胞的生长、活化和分化，是IgG1和IgE类抗体的转换因子，其功能亢进将导致特异性过敏反应，参与高IgE综合症和嗜酸性粒细胞增多症。现在是26页\一共有44页\编辑于星期日(3)活化淋巴细胞亚群活化总T细胞：CD3+/HLA—DR+静止总T细胞：CD3+/HLA—DR-活化CD4+细胞：CD4+/HLA—DR+活化CD8+细胞：CD8+/HLA—DR+活化诱导分子：CD69白细胞介素2低亲和力受体：CD25CD25+/CD3+：活化T细胞CD25-/CD3+：静止T细胞现在是27页\一共有44页\编辑于星期日(4)淋巴细胞功能分析：细胞介导细胞毒试验、细胞内细胞因子的测定自身免疫性疾病变态反应性疾病免疫缺陷性疾病感染性疾病(病毒、细菌、寄生虫感染)免疫治疗监测肿瘤免疫监测移植免疫监测现在是28页\一共有44页\编辑于星期日(二)FCM在临床血液学中的应用1.白血病的MIC分型Morphology（形态学）Immunology（免疫学）Cytogenetics（细胞遗传学）白血病分型是选择化疗方案和判断预后的重要依据。白血病免疫分型是MIC分型的重要组成部分，也是对FAB分型的补充，对白血病的诊断、治疗策略制定、预后判断及对白血病发病机制的研究都具有重要作用。现在是29页\一共有44页\编辑于星期日免疫分型的临床意义

弥补FAB分型的不足

诊断其他血液系统肿瘤

诊断仅表达个别非本系列相关抗原的急性白血病（LY+—AML、MY+—ALL）

急性双系或双表型白血病的诊断

骨髓增生异常综合征（MDS）免疫表型分析的临床意义

免疫分型对鉴别慢性淋巴细胞增生性疾病各亚型亦有肯定的诊断价值现在是30页\一共有44页\编辑于星期日以下为各系列较特别的标志：

AML：

MPO、CD33、CDl3、CDl4CDl5、CDllb、CDllc

T-ALL：

c／mCD3、CD2、CD5、CD7、CD4／CD8、CD38

B-ALL：

cCD22、cCD79、CDl9、CDl0、CD24、HLA—DR、CD20、CD38

造血干／祖细胞:CD34、CDll7、CD38、HLA-DR、ACl33现在是31页\一共有44页\编辑于星期日在AML各亚型的免疫分型中有时仍较难分辨，有以下特点可供参考：

①CD41、CD61是巨核细胞的标志，见于FAB—M7，但血小板粘附于某细胞上可造成假阳性。

②CD71与血型糖蛋白是红系的标志，见于FAB—M6型。

③CDl4、CD64是单核细胞的标志，见于M4或M5。

④FAB—M3，t(15；17)者典型的免疫表型是CDl3+、CD33+、CD9+、CD38+、CD34-、DR-。

⑤t(8；21)M2的表型为CDl3+、DR+、CD34+、CD33+、CDl5+、CDl9+或CD56+。

⑥M0与M1较难区分，应有髓系标志而无淋系标志，胞浆MPO应阴性。CD34及DR在M0较强，并可伴有CD7与CD4。现在是32页\一共有44页\编辑于星期日

⑦CDll7+多见于AML。

⑧CD7常与CD34共表达，CD4见于M4、M5。CD2+见于M4Eo，往往伴有16号染色体异常。M3亦可有CD56+表达。正常粒细跑可表达CDl0。由此可见，单抗本身有其多向性，勿轻易判断为杂合型白血病。

⑨T／B—ALL可分为几个亚型，然而对临床价值不大。但若B—ALL伴有CD34表达时，应进一步作遗传学与基因检测，以确定是否是Ph+ALL，不论是M—bcl/abl或m-bcr／ablmRNA阳性者，其预后均较差，应接受大剂量化疗或早期接受异基因骨髓移植。现在是33页\一共有44页\编辑于星期日FCM检测白血病微小残留病变(MRD):过去认为FCM测定残存白血病细胞不可靠，因为现用的McAb不能鉴别正常血细胞与白血病细胞。虽然至今尚未发现白血病细胞特异抗原，但近来有人提出根据白血病细胞的以下特征，FCM检测的敏感度可明显提高现在是34页\一共有44页\编辑于星期日白血病细胞的某些抗原表达量明显高于相应的正常血细胞

如小儿ALL，其CDl0+细胞的荧光强度可高达3-4个对数值，而其CD45则为弱阳性或阴性。相应正常细胞CDl0+的细胞荧光强度约为2个对数值，CD45为阳性。若能定量则更可靠。现在是35页\一共有44页\编辑于星期日FCM在临床肿瘤学中的应用1.血液标本的检查肿瘤患者的免疫功能检查肿瘤患者的粘附分子检查ICAM-1CD54ICAM-2CD102ICAM-3CD106CD62、CD63、CD42a/b、CD41/61、TSP现在是36页\一共有44页\编辑于星期日(2)肿瘤实体标本的FCM检查耐药基因检查粘附分子检查细胞凋亡检查细胞DNA分析增殖性核抗原肿瘤细胞耐药性筛选肿瘤相关抗原激素受体与癌细胞生物行为有关的因子，如CD44现在是37页\一共有44页\编辑于星期日组织标本的正确处理：

去除脂肪、结缔组织洗涤除去红细胞用眼科剪剪成肉糜状用250至350目的铜网过滤要求：

细胞碎片、细胞连片少，单细胞要多现在是38页\一共有44页\编辑于星期日利用特殊的荧光染料(PI、EB、AO等)与细胞内DNA碱基结合，被这些荧光染料染色的