总则实验微生物形态观察

总则实验微生物形态观察第1页，共21页，2023年，2月20日，星期六如何进行环境生物学实验严肃认真科学态度分析问题搞清原理第2页，共21页，2023年，2月20日，星期六实验安排与考核预习情况+实验操作+总结报告微生物形态观察水中细菌总数的测定浊度的测定

第3页，共21页，2023年，2月20日，星期六课堂纪律严格遵守实验室规章制度严肃课堂纪律不允许无故旷课、早退迟到工作服实验室严禁吸烟注意用水、防电和防火正确使用化学试剂和仪器第4页，共21页，2023年，2月20日，星期六实验一微生物形态观察

实验目的学习在油镜下观察生物个体形态。了解革兰氏染色法的原理并熟练掌握操作步骤。第5页，共21页，2023年，2月20日，星期六实验原理革兰氏染色原理由于细菌细胞壁的结构和化学组成不同，经染色后，呈现不同的染色反应，将所有细菌区分为两大类，即革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫-碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力染色关键在于脱水溶剂的脱色作用G+细胞壁通透性低，结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色G-

细胞壁通透性高，结晶紫-碘的复合物易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色第6页，共21页，2023年，2月20日，星期六1、菌种：培养12-16h的枯草杆菌（Bacillussubtilis），培养24小时的大肠杆菌（Escherichiacoli）

2、染色液和试剂：草酸铵结晶紫染液、卢哥氏碘液、95%酒精、番红染液、二甲苯溶液、香柏油、无菌水3、器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜等。实验器材第7页，共21页，2023年，2月20日，星期六实验内容1.涂片：取少量菌放在载玻片上，在酒精灯上烤一下，固定细菌。（火焰固定不宜过热，以玻片不烫手为宜）2.染色：第8页，共21页，2023年，2月20日，星期六实验内容1、涂片无菌操作技术灼烧接种环拔去棉塞烘烤试管口挑取少量菌体再烘烤试管口将棉塞塞好做涂片烧去残留菌体第9页，共21页，2023年，2月20日，星期六实验内容注意事项：①涂片不宜过厚②火焰固定不宜过热③滴加染色液与酒精时一定要覆盖整个菌膜④乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。2、革兰氏染色技术涂片干燥固定草酸铵结晶紫初染碘液媒染95%乙醇脱色沙黄复染镜检1min1min1min水洗水洗水洗水洗30s滤纸吸干第10页，共21页，2023年，2月20日，星期六1234？结晶紫碘液酒精复红第11页，共21页，2023年，2月20日，星期六1、简单染色(四）实验方法：制片→染色→水洗→干燥→镜检（1）制片：取菌种培养物常规涂片、自然干燥、加热固定；注意无菌操作第12页，共21页，2023年，2月20日，星期六（2）染色：将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加复红染色1-2min。（3）水洗：用水洗去涂片上的染色液。（4）干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。（5）镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。第13页，共21页，2023年，2月20日，星期六crystalvioletstainwashwithwater

Stainwithgram'siodinesolution

Decolorizebyadding95%alcohol第14页，共21页，2023年，2月20日，星期六

革兰氏阴性杆菌革兰氏阳性杆菌

CounterstainwithSafranin

第15页，共21页，2023年，2月20日，星期六①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净：a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。b.用擦镜纸沾少许二甲苯液将镜头擦2-3次。c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2-3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。将显微镜小心轻拿。

②观察后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净，放入回收容器内。（10）实验完毕后的处理第16页，共21页，2023年，2月20日，星期六1、载玻片要洁净无油迹。涂片时，滴水不要过多，挑菌量宜少，涂片要均匀，菌膜宜薄。2、革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。？（五）注意事项3、染色过程中勿使染色液干涸。4、选用幼龄的细菌。第17页，共21页，2023年，2月20日，星期六不经复染这一步，能否区别革兰氏阳性菌和阴性菌？哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性?其中最关键的环节是什么?

实验报告第18页，共21页，2023年，2月20日，星期六显微镜的使用显微镜的构造：分机械装置和光学系统1.物镜转换器；2.物镜；3.游标卡尺；4.载物台；5.聚光器；6.虹彩光圈；7.光源；8.镜座；9.电源开关；10.光源滑动变阻器；11.粗调螺旋；12.微调螺旋；13.镜臂；14.镜筒；15.目镜；16.标本移动螺旋第19页，共21页，2023年，2月20日，星期六实验原理

增加照明亮度在镜头与标本玻片之间滴上与玻璃的折射率相仿的油类，则光线不发生折射，从而增加了视野的照明亮度

增加显微镜的分辨力指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力油镜的工作原理如香柏油(n=1.52)分辨力(最大可分辨距离)=λ/2NA以空气为介质时，NA=1×0.87=0.87以香柏油为介质时，NA=1.52×0.87=1.32分辩力较高，故细菌用油镜才可观察到第20页，共21页，2023年，2月20日，星期六1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。4.观察时，两眼睁开，养成两眼能够轮换观察的习惯，以免眼睛疲劳，并且能够在左眼观察时，右眼注视绘图。