怎样用好液相色谱

怎样用好液相色谱第1页，共47页，2023年，2月20日，星期六液相色谱分析

分析方法建立的实例有机污染物的影响（二）“三蒸水”有大量的有机污染物不适合梯度分析第2页，共47页，2023年，2月20日，星期六液相色谱分析

分析方法建立的实例有机污染物的影响（三）典型的“实验室水”有大量的有机污染物不适合高灵敏度梯度分析第3页，共47页，2023年，2月20日，星期六液相色谱分析

分析方法建立的实例梯度方法开发实例-第一步开发一个有9个烷基苯酮化合物的梯度方法，用C18柱，在最初的条件下(0-100%水-乙腈)，分离不理想。整个色谱峰组保留时间太长，分离度也不好第4页，共47页，2023年，2月20日，星期六液相色谱分析

分析方法建立的实例梯度方法开发实例-第二步为使色谱峰前移，提高起始时乙腈的比例（50-100%，水-乙腈），分离得到改善。但是9个化合物出了10个色谱峰，说明有杂质存在，很可能是流动相水中的。第5页，共47页，2023年，2月20日，星期六液相色谱分析

分析方法建立的实例梯度方法开发实例-第三步

从空白梯度图显示，在同样的色谱条件，同样的检测灵敏度下，共有两个杂质峰。说明流动相水中的杂质在此条件下可能会对检测有影响。第6页，共47页，2023年，2月20日，星期六液相色谱分析

分析方法建立的实例梯度方法开发实例-第四步

空白梯度图同样品的色谱图进行对照后，我们看到杂质（共两个峰）中的第一个小峰对第8个色谱峰有干扰，会使其定量分析结果不准确。第7页，共47页，2023年，2月20日，星期六液相色谱分析

分析方法建立的实例梯度方法开发实例-第五步根据“梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强”的规律，试用#5曲线使3-9号峰提前(曲线5，50-100%B)，但是小峰仍没有分出来。第8页，共47页，2023年，2月20日，星期六液相色谱分析

分析方法建立的实例梯度方法开发实例-第六步

根据“梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强”的规律，试用#5曲线使3-9号峰提前，改用50-95%B见到好的现象。第9页，共47页，2023年，2月20日，星期六液相色谱分析

分析方法建立的实例梯度方法开发实例-第七步最后用50-90%B，曲线4，得到好的结果。第10页，共47页，2023年，2月20日，星期六液相色谱分析液相色谱的检测模式项目示差折光电导紫外荧光电化学响应通用选择性选择性选择性选择性灵敏度毫克纳克纳克皮克皮克线性范围104106105105106流速敏感是是否否是温度敏感是是否否是梯度淋洗不可有限制可以可以脉冲可以灵敏度、选择性、适应能力第11页，共47页，2023年，2月20日，星期六液相色谱分析开发液相色谱分析方法分辨率是色谱分析中主要考虑的因素。在开发色谱方法时，有很多因素是很重要的。除分辨率之外，以下因素都要考虑。

1.灵敏度5.成本

2.载样量6.容易使用

3.分析速度7.色谱柱寿命

4.溶剂消耗8.效率第12页，共47页，2023年，2月20日，星期六液相色谱分析液相色谱分析方法的建立1建立液相色谱分析方法通常有以下几步：（1）分子量－在样品预处理或GPC分析时有用（2）选择合适的液相色谱方法（正相、反相或其他）；（3）选择合适的色谱柱；（4）溶解度－选择流动相的条件（5）官能团－有否离子化基团？保留特性如何？（6）样品的基质－考虑是否要前处理，如何前处理第13页，共47页，2023年，2月20日，星期六液相色谱分析液相色谱分析方法的建立2续前一页（7）选择合适的K’值的条件；（8）选择良好的峰位（a值）；（9）选择良好的色谱柱条件（N值）；（10）检测特性－是否有紫外吸收？荧光？（11）用实测样品解决出现的特殊问题；（12）证实方法的正确性。第14页，共47页，2023年，2月20日，星期六方法样品特点/色谱柱何时应用该方法反相HPLC流动相：水/有机溶剂色谱柱：C18（ODS），C8，苯基，三甲基硅烷，氰基首选为能溶于水/有机混合物的中性或非离子化合物。离子对HPLC流动相：水/有机溶剂（一种缓冲物控制pＨ和离子对试剂）色谱柱：C18（ODS），C8，氰基离子或可电离化合物，尤其是碱性或阳离子化合物的良好选择正相HPLC流动相：有机溶剂混合液色谱柱：氰基，二醇基，氨基，硅胶当反相或离子对HPLC无效时的第二个较好选择；首选为不溶于水/有机混合液的亲脂样品，异构体混合物和制备HPLC硅胶最好液相色谱分析选择液相色谱的方法主要液相色谱方法特性第15页，共47页，2023年，2月20日，星期六方法描述/色谱柱何时应用该方法离子交换色谱法流动相：水相，另以缓冲物控制pH色谱柱：阳离子或阴离子交换分离无机离子混合物的首选（离子色谱法）；分离蛋白质、核酸样品及有关化合物的良好选择体积排阻色谱法流动相：水相（GFC）或有机相（GPC）色谱柱：GFC用二醇基，GPC用聚苯乙烯或硅胶，孔径大小支配分子量范围分离大分子样品，如蛋白质和人造聚合物的良好首选，也可用于测量分子量的分布疏水作用色谱法流动相：盐溶液色谱柱：类似于反相填料，但疏水性小得多用于分离蛋白质液相色谱分析选择液相色谱的方法次要液相色谱方法特

性第16页，共47页，2023年，2月20日，星期六液相色谱分析液相色谱的保留保留时间tR的初步估计：保留时间tR

＝死时间t0(1+峰容量因子k’）峰的容量因子k’＝（保留时间tR－死时间t0）/死时间t0t0≈0.5Ld2左式中：

t0－进样峰的出峰时间tR=t0(1+k’)tR－峰的保留时间

L－柱长(cm)k’=(tR-t0)/t0d－柱内径(cm)

k’－峰的容量因子

第17页，共47页，2023年，2月20日，星期六液相色谱分析反相色谱不同配比流动相与容量因子值甲醇/水乙腈/水四氢呋喃/水峰容量因子值0/1000/1000/10010010/906/944/964020/8012/8810/901630/7022/7817/83640/6032/6823/772.550/5040/6030/70160/4050/5037/630.470/3060/4045/550.280/2073/2753/470.0690/1086/1463/370.03100/0100/072/280.01第18页，共47页，2023年，2月20日，星期六液相色谱分析溶剂强度

改变流动相的组成或溶剂的强度，就可以改变K’和tR。在一定的条件下，减少保留时间或缩短分析时间的溶剂（小tR和K’值）为强溶剂，增加或延长分析时间的溶剂（大tR和K’值）为弱溶剂。例如，在反相色谱中，水是弱溶剂。在甲醇/水为流动相的系统中增加甲醇的比例，流动相变强。液相色谱的溶剂由弱到强排列的顺序为：正己烷、氯仿、二氯甲烷、甲基叔丁醚、乙醚、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙腈、丙醇、甲醇。

在反相色谱中有机溶剂增加10％左右，tR和K’值要减少2-3倍。第19页，共47页，2023年，2月20日，星期六液相色谱分析峰位的重排在分析多组分样品时，仅改变流动相的强度（组成百分比）而不改变其组成，一般仅仅改变所有组分的tR，不会发生峰位重排。在反相色谱中，下列条件改变可能发生峰位重排：（1）流动相中换了强溶剂种类；（2）pH值的改变；（3）柱填料的改变；（4）柱温的改变；（5）流动相组成的改变（如加入离子对试剂三乙基胺等）第20页，共47页，2023年，2月20日，星期六液相色谱分析液相色谱压力计算（0.46内径柱）式中L――柱长

e――流动相粘度

F――流速，mL/mindc――柱内径，cmdp――柱填料直径，um

反相色谱常用流动相的粘度值（mPa·s）（25℃）有机溶剂/水（体积比）甲醇乙腈四氢呋喃0/1000.890.890.8920/801.40.981.2240/601.620.891.3860/401.540.721.2180/201.120.520.85100/00.560.350.46下表红线框内的数字即为该溶液与水混合后的粘度（在25℃时）

即e第21页，共47页，2023年，2月20日，星期六液相色谱分析实验室常备的流动相和固定相

为满足液相色谱的方法选择，实验室应该常备以下的流动相和固定相（1）流动相：甲醇、乙腈、纯水、四氢呋喃、正己烷二氯甲烷，这些溶剂基本上能满足90％以上的液相色谱分离问题。（2）固定相：C18键合相柱、硅胶柱、氰基柱合氨基柱。几点注意事项

色谱柱和流动相确定以后，为想获得满意的色谱分离，可进一步选择柱长、填料粒度和流速等。需要指出的是某些样品在进样前要进行很完全的样品预处理，另外，许多样品则需要梯度洗脱，当色谱条件有所改变时，需要寻找更合适的分离条件。第22页，共47页，2023年，2月20日，星期六液相色谱仪的使用流动相及储液器1.尽量使用HPLC级的溶剂与试剂.2.最好使用专用的溶剂瓶来放置流动相3.改变流动相时防止交叉污染.4.不要使用陈旧的流动相.5.定期更换流动相储液瓶.6.定期清洗烧结不锈钢吸滤头.7.定期清洗烧结不锈钢吸滤头.第23页，共47页，2023年，2月20日，星期六液相色谱仪的使用对流动相的要求

由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲和力，并参与固定相对组分的竞争。因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：

（1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。

（2）溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。第24页，共47页，2023年，2月20日，星期六液相色谱仪的使用对流动相的要求

（3）高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。痕量杂质的存在，将使截止波长值增加50—1OOnm。（4）化学稳定性好。不能选与样品发生反应或聚合的溶剂。（5）低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离.第25页，共47页，2023年，2月20日，星期六液相色谱仪的使用常用流动相的紫外截止波长溶剂正己烷二硫化碳四氯化碳苯氯仿二氯甲烷四氢呋喃丙酮乙腈甲醇水紫外截止波长nm190380265210245233212330190205187第26页，共47页，2023年，2月20日，星期六液相色谱仪的使用常用流动相的强度参数溶剂ε0溶剂ε0溶剂ε0氟烷－0.25苯0.32乙腈0.65正戊烷0.00氯仿0.40吡啶0.71石油醚0.01甲乙酮0.51正丙醇0.82环己烷0.04丙酮0.56乙醇0.88四氯化碳0.18二乙胺0.63甲醇0.95第27页，共47页，2023年，2月20日，星期六液相色谱仪的使用设备和材料：溶剂过滤器、真空泵、0.45u或更细的水性滤膜和有机滤膜过滤的方法：用加了滤膜的溶剂过滤器和真空泵抽滤过滤的目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。必须做!溶剂和水的前处理：过滤第28页，共47页，2023年，2月20日，星期六液相色谱仪的使用设备和材料：超声波清洗机脱气的目的：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡气泡对测定的影响：

1）柱流量不准

2）检测器基线波动脱气注意点：

1）每天脱气(无在线脱气器时）

2）混合溶剂脱气时间不能过长必须做!溶剂和水的前处理：脱气第29页，共47页，2023年，2月20日，星期六液相色谱仪的使用自动进样器手动进样器原理：六通阀注入方式：

1）全量注入

2）部分注入进样器样品装填状态

(LOAD)手动进样器原理图注射状态(INJECT)第30页，共47页，2023年，2月20日，星期六液相色谱仪的使用分析结果重现性好提高柱效降低柱压保证检测稳定性

柱温控制的优点：使用柱温箱第31页，共47页，2023年，2月20日，星期六液相色谱仪的使用高压输液泵1.每次使用后要把泵中的含盐缓冲液洗干净，防止盐的沉积，泵要浸在无缓冲液的溶液或有机溶剂中。2.使用HPLC级的流动相试剂.3.使用不锈钢烧结吸液滤头.4.用纯水或双蒸蒸馏水，流量3～5ml/分，冲洗15分钟，冲洗时必须打开排放阀（逆时针拧松）必须做!使用输液泵的注意事项第32页，共47页，2023年，2月20日，星期六液相色谱仪的使用高压进样阀必须做!每次使用后要冲洗干净进样阀中残留的样品和缓冲盐.防止无机盐沉积和样品微粒磨损阀转子.冲洗方法见进样阀说明书.严禁用!严禁使用气相色谱那样的尖头针进样.根据情况定在注射针前加装针式过滤器,防止样品中的微粒进入进样阀.第33页，共47页，2023年，2月20日，星期六液相色谱仪的使用液相色谱柱1.流动相或溶剂的化学腐蚀性不能太强.2.避免样品微粒在柱头沉积.3.防止过高压力冲击色谱柱.4.流动相pH大于7时要使用保护柱.5.正确制备样品,在样品注射器前加装针式过滤器.6.色谱柱不用卸下前:a.必须洗去缓冲液.b.防止产生微生物c.用大于10%的有机溶剂充满整个色谱柱.d.柱卸下后用柱堵头将色谱柱首尾密封.第34页，共47页，2023年，2月20日，星期六液相色谱仪的使用紫外检测器每次做1.流过池每次使用后连同色谱柱一起清洗.2.使用脱过气的流动相,防止气泡卡在流过池内.经常做3.不定期的用强溶剂反向冲洗流过池(拆开柱子).4.不定期的使用空流过池校正波长.根据情况定5.在流过池出口加装背压阀.第35页，共47页，2023年，2月20日，星期六液相色谱仪的使用操作极限预防1.严禁在无流动相时启动高压输液泵.2.设定泵的上限压力(≤25Mpa)防止长期压力过高损坏泵和进样阀.3.设定泵的下限压力(0.5～1Mpa)防止流动相抽干和严重泄漏.第36页，共47页，2023年，2月20日，星期六液相色谱仪的使用整台液相色谱仪的维护1.在使用过含盐缓冲液后必须清水冲洗泵15分钟，此时必须打开排放阀，不能使废液进入色谱柱。2.关上排放阀，用90%+10%的水、甲醇溶液冲洗整个系统，时间为15～20分钟，流量1ml/分。本步骤主要是冲洗干净系统内其他含盐的部位。3.用纯的强溶剂冲洗整个系统，时间为1小时，流量为1ml/分。本步骤主要是保护色谱柱。4.如果未使用缓冲液，上面1、2两步骤可免去，直接用纯的强溶剂冲洗整个系统，时间为1小时，流量为1ml/分。每次用过仪器后必须做!第37页，共47页，2023年，2月20日，星期六液相色谱仪使用中的问题A.不进样时柱压连续升高+流动相有颗粒+流动相溶解性+流动相的不稳定性(聚合)+形成柱死体积(与使用条件有关)B.进样时压力升高+样品有颗粒+样品在流动相中不溶+样品组分与固定相不兼容压力问题第38页，共47页，2023年，2月20日，星期六液相色谱仪使用中的问题A.所有峰都向低保留值方向漂移（酸、碱、中性化合物）-键合相流失-流动相不稳定(可能性较小)-溶剂输送系统(流速变化)B.所有峰都向高保留值方向漂移-在水/有机溶剂的混合体系中，有机溶剂含量减少-

柱改变(可能性较小)-溶剂输送系统(流速变化)C.离子型化合物的色谱峰的保留值漂移-流动相中挥发性组分损失(离子强度,pH漂移)-

柱改变(键合相或污染)保留值漂移第39页，共47页，2023年，2月20日，星期六液相色谱仪使用中的问题

A.与流动相有关的问题#使用新鲜的流动相B.与色谱柱有关的问题#测试新柱#

用标准的测试混合样测试新柱#“清洗”色谱柱后再测#考虑样品基质与使用条件对柱稳定性的影响保留值漂移第40页，共47页，2023年，2月20日，星期六液相色谱仪使用中的问题预柱与保护柱从泵来的流动相预柱进样器保护柱分析柱到检测器预柱对流动相而言保护柱对色谱柱而言第41页，共47页，2023年，2月20日，星期六液相色谱仪使用中的问题良好的柱使用规范在使用前过滤溶剂完全润湿在运输中变干的色谱柱了解溶剂对样品的溶解性及对分离的影响对含有保留性较强的杂质组份的样品进行预处理注意柱子的pH使用范围定期用强极性的溶剂清洗色谱柱储存色谱柱时要冲尽缓冲液,并用有机溶剂饱和柱子避免外力损伤色谱柱,如弯曲、跌落等第42页，共47页，2023年，2月20日，星期六液相色谱仪使用中的问题使用保护柱带整体过滤片的Techtron保护柱第43页，共47页，2023年，2月20日，星期六液相色谱柱维护色谱柱压力升高原因1：溶剂中的不溶物—

应使用色谱纯溶剂，膜过滤（孔径不超过0.45μm）原因2：样品中的不溶物—

应对样品进行膜过滤（孔径不超过0.45μm）原因3：泵，进样器等中的不溶物—

在泵和进样器之间安装内置过滤器，在进样器和柱之间安装预过滤器原因4：柱内不溶物的形成4-1．由于溶剂的不互溶而产生的沉淀—用能溶解沉淀物的溶剂冲洗色谱柱4-2．在不互