微卫星筛选方法

微卫星筛选方法课件第1页，共23页，2023年，2月20日，星期六什么是微卫星（Microsatellite）？

短串联重复(shorttandemrepeat，STR)简单序列重复(simplesequencerepeat，SSR)由1-5个核苷酸为重复单位串联组成的长达几十个核苷酸的序列,重复数为10~20次含有串联重复的核心序列两侧较保守的侧翼序列

动物体中以双核苷酸（CA/GT）n最为常见第2页，共23页，2023年，2月20日，星期六广泛分布于各种真核生物基因组中，非常丰富且分布比较均匀数量多、特异的PCR扩增、稳定性好、在基因组内分布均匀、多态性信息丰富、易于检测第3页，共23页，2023年，2月20日，星期六完美（perfect）重复型第4页，共23页，2023年，2月20日，星期六不完全（imperfect）重复型第5页，共23页，2023年，2月20日，星期六复合（compound）重复型第6页，共23页，2023年，2月20日，星期六所有的微卫星分离筛选实验都是沙里淘金的过程第7页，共23页，2023年，2月20日，星期六传统筛选法使用限制性内切酶或者声波处理使基因组片段化电泳切胶选择300-700bp的片段作为筛选库连接到质粒中转化入感受态细胞中与放射性的探针做Southern杂交，选择出阳性克隆后进行测序、引物设计和引物最优化第8页，共23页，2023年，2月20日，星期六第9页，共23页，2023年，2月20日，星期六传统筛选法缺点：实验成本高、耗时长而无法大批量操作，并且由于使用放射性元素而使得操作过程不安全。第10页，共23页，2023年，2月20日，星期六基于引物扩增的方法基因组片段化和片段大小选择把片段转入噬菌体中从而得到一个单链的DNA库以这些ssDNA为模板，以重复碱基引物做PCR扩增，得到筛选库第11页，共23页，2023年，2月20日，星期六基于引物扩增的方法缺点：操作繁杂，使用重复碱基引物扩增的效率较低从而使得一些较稀少的位点被忽略，并且这个方法在筛选三四碱基重复的位点时会出现单克隆的多拷贝情况第12页，共23页，2023年，2月20日，星期六选择性杂交法对目标物种的基因组进行片段化和片段大小选择将片段接入质粒或者加上接头与一定的探针杂交，杂交后的片断可以选择杂交筛选和磁珠吸附两种方法对杂交片段进行富集第13页，共23页，2023年，2月20日，星期六FLASCO法（FastisolationbyAFLPofSequencesCOtainingrepeats）跳过对基因组片段化和大小的选择充分利用了基因组，以免稀有微卫星的丢失。步骤较为简单，方便快速，优化效率高，实验成本较低。第14页，共23页，2023年，2月20日，星期六1DNA抽提2酶切连接3AFLP特异扩增4探针杂交5磁珠洗脱6双链恢复7质粒连接8转化克隆9单克隆扩增培养10菌落PCR选择目标克隆11测序12引物设计及优化13荧光PCR及基因分型14数据分析第15页，共23页，2023年，2月20日，星期六（1）DNA抽提 -Sambrooketal.1989；其它方法（2）酶切连接 -MseI+T4Ligase（3）AFLP特异扩增DNA片段-酶切连接液为模板-MesI–N引物第16页，共23页，2023年，2月20日，星期六（4）探针杂交-5，端生物素修饰的重复碱基探针与扩增产物杂交（5）磁珠洗脱-磁珠特异性吸附杂交片段，洗脱除去未杂交片段第17页，共23页，2023年，2月20日，星期六（6）双链恢复-磁珠富集得到的目的单链以MesI-N为引物特异扩增恢复为双链（7）质粒连接-PMD18-Tvector第18页，共23页，2023年，2月20日，星期六（8）转化克隆-DH5-α感受态细胞涂板，37℃培养11-13h（9）单克隆扩增培养-挑取白色饱满菌落液体培养基培养5h

（10）菌落PCR选择目标克隆-三引物法扩增产物为双带第19页，共23页，2023年，2月20日，星期六（11）测序-目标克隆菌液测序（12）引物设计及优化-CID软件分析序列及设计引物-引物扩增条件优化（13）荧光PCR及基因分型-荧光修饰引物特异扩增-基因分型第20页，共23页，2023年，2月20日，星期六（14）数据分析-Genescan读取基因分型数据-位点多态性信息-位点是否偏离