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文档简介
分类号:R11 学校代码:1043密级 学号 201312题题目抗雄激素物质对去势大鼠联合作用的实验研院、系(所)公共卫生与管理学 卫生毒理类 医学科学学燕高峰 李志华教授刘兆平研究员张文众研究起止日期 2014年10月-2016年04一、中 二、英 三、缩略 前 第一部分DEHP、DBP、VZ抗雄激素作用剂量-反应关系研 材料与方 结 讨 小 第二部分DEHP、DBP、VZ抗雄激素作用联合作用模式研 材料与方 结 讨 小 五、全文结 六、参考文 七、文献综 八、致 九、攻 期间撰写 抗雄激素物质对去势大鼠联合作用的实验 专业 卫生毒理 李志华教授中(DEHP方法:本研究分两步进行第一步:DEHP、DBPVZ抗雄激素作用的单独效应和剂量-反应关系研6SD168DEHP、DBP和VZ抗雄激素作用,每批次56只,随机分为87只。bw;阳性对照用氟他胺3.0mg/kgbw,灌胃,连续10d。bw;阳性对照用氟他胺3.0mg/kgbw,灌胃,连续10d。阳性对照用氟他胺3.0mg/kgbw,灌胃,连续10d。灌胃前各组均皮射丙酸睾酮(TP。试验结束后测定雄激素依赖性组(LOAEL(BMDL析因设计方案,将去势SD大鼠按照体重随机分为8组(7只/组):1个对LOAEL(分别为、、mg/kg,染毒方法和检测指标同第一步。采用“2×2×2析因设计”方差分析法和“剂量相加法”DEHP、DBPVZ抗雄结果:第一部分DEHP、DBPVZ抗雄激素作用的单独效应和剂量-反应关DEHP中高剂量组(、、mg/kgbw)腹侧、肛提肌-肌、球腺重量低于对照,有统计学意义(P<0.05DBP中高剂量组(、、mg/kgbw)肛-肌、球腺重量低于对照组,差异有统计学意义(P0.05VZ在5个剂量组(12、25、50、75、100mg/kgbw)、-肌、球腺重量低于对照,差异有统计学意义(P<0.05基准剂量分析显示,DEHP、DBP和VZ对各雄激素依赖性组织的影响具有剂量-反应关系,Hershberger试验,如果剂量组中两个或两个以上150.38、276.783.50mg/kg.bw。DEHP、DBPVZ对去势大鼠的体重和血(P>0.05DEHPDBPVZ抗雄激素联合作用及其模式研究结果。DEHP和DBP联合染毒对肛-肌的影响为拮抗作用;DBP和VZ联合染毒对头、腹侧、肛肌、球腺重量的影响均为拮抗作用;他的联合作用模式均为简单相加作用。“剂量相加法”分析发现,以球腺为作用终点,DEHP和DBP、DBP和VZ联合作用模式为拮抗作用;其他的联合结论:雄激素依赖性组织对DEHP、DBP和VZ作用均有阳性表现,肛提肌-肌、球腺较其他指标敏感。DEHP、DBP和VZ对雄激素依赖性50012mg/kgbw,基准剂量下限分别为150.38、276.783.50mg/kg.bw。DEHP、DBP和VZ共同表现出联合抗雄激素作用,基于所有雄激素依赖性组织重量指标的“2×2×2析因设计”方差分析和基于球腺重量指STUDYONCOMBINEDEFFECTOFENVIRONMENTALANTIANDROGENFORCASTRATERATS YanGaofeng LiuZhao ObjectiveTostudythesensitiveendpointsandthedose-responserelationshiponthesimpleeffectionofantiandrogentoxicologicalfunctionincastrateratsbyDEHP,DBPandVZandtoexplorethecombinedeffectandthemodelsofantiandrogen.MethodsThestudyconsistsoftwoFirstly,tostudythesimpleeffectionandthedose-responserelationshipofantiandrogentoxicologicalfunctionbyDEHP,DBPandVZ.Totalof168maleSDratsat6weekswereselectedanddividedinto3batches(DEHP,DBPandVZ),averybatchhave56ratsandrandomlydividedinto8groups.DEHP(35,70,150,250,500,1000mg/kgBW),DBP(70,150,250,500,750,1000mg/kgBW)andVZ(6,25,50,100mg/kgBW)weregivenbyoralgavage,respectively.Meanwhile,coinoilwasgivenbyoralgavageasanegativecontrol,and3.0mg/kgBWflutamidewasgivenbyoralgavageasapositivecontrolfor10consecutivedays.Inaddition,0.2mg/kgBWtestosteronepropionatewasgiventoeverygroupsbysubcutaneouslyinjectbeforegavage.Intheendoftest,animalswereanesthetized,weightsofandrogen-dependenttissues(penis,ventralprostate,seminalvesicles,levatorani-bulbocavernosusmuscles,Cowper’sglands)weremeasured,testosteroneandluteinizinghormonelevelsweremeasured.NOAELandLOAELvalueswereysedbasedontheexperimentdata.Thedose-responsewasyzedbybenarkdoessoftware,andgenerateBMDsandBMDLsforeachchemical.Secondly,tostudyoncombinedeffectofDEBP,DBPandVZforrats.CastrateSDratsweredividedinto8groupsbasedon2×2×2factorialdesigns.Chemical(doseofeachbasedonLOAEL)weregivenbyoralgavage,respectively.Inaddition,0.2mg/kgBWtestosteronepropionatewasgiventoeverygroupsbysubcutaneouslyinjectbeforegavage.Intheendoftest,animalswereanesthetized,weightofpenis,ventralprostate,seminalvesicles,levatorani-bulbocave-rnosusmuscles,Cowper’sglandsweremeasured,testosteroneandluteinizinghormonelevelsweremeasured.Studyoncombinedeffectofantiandrogenfunctionforcastrateratby2×2×2factorialdesignsand“doseaddition”theory.ResultsThefirstresults:Incomparisonwithnegativecontrol,weightofventralprostate,levatorani-bulbocavernosusmusclesandCowper’sglandsweresignificantlydecreasedinthegroupof250,500and1000mg/kgBWbytheDEHP(P<0.05),weightoflevatorani-bulbocavernosusmusclesandCowper’sglandsweresignificantlydecreasedinthegroupof500,750and1000mg/kgBWbytheDBP(P<0.05),andweightofseminalvesicle,levatorani-bulbocavernosusmusclesandCowper’sglandsweresignificantlydecreasedinthegroupof12,25,50and100mg/kgBWbytheVZ(P<0.05).Andhavethedose-responserelationshipofantiandrogenofDEHP,DBPandVZincastraterats.TheBMDLofDEHP,DBPandVZwas150.38,276.78and3.50mg/kgBWrespectively.Theratsweightandserumhormore(T/LH)werenotsignificantlychange.Thesecondresults:onthelevatorani-bulbocavernosusmuscleswasantagonismeffectscombingwithDEHPandDBP;onthepenis,ventralprostate,levatorani-bulbocavernosusmusclesandCowper’sglandswereantagonismeffectscombingwithDBPandVZ.Resultsof“doseaddition”theory:combinedeffectsofDEHPandDBPonCowper’sglandswasantagonismeffects,andcombinedeffectsofDBPandVZwasantagonismeffects,too.ConclusionAndrogen-dependenttissueshavesensitivereactionstofunction.AntiandrogenfunctionofDEHP,DBPandVZeffectsratswithsignificantdose-responserelationship.TheLOAELsofDEHP,DBPandVZare250,500and12mg/kgbw,andtheBMDLare150.38,276.78and3.50mg/kgbw.;ThemodesofcombinedeffectofDEHP,DBPandVZareadditivityandantagonism.:DEHP;DBP;VZ;Hershbergerbioassay;anti-androgenic;benarkdoes;factorialdesign;doseaddition;modeofcombination.AkaikeinformationBenark arkdoeslowerBenarkdoes arkDibutylDiethylhexylEndocrine-disruptingEuropeanFoodSafetyEnvironmentalProtectionLuteinizingLowestobservedadverseeffectNegativeNoobservedeffectPhthalatePositiveTTestosteronechemicalsEDCs量和数减少,活动度降低,畸形率升高等[1]。雄激素生物学子(AR活化之后在一系列的共调节因子作用下形成同源二聚体,进而与靶基因结合[2,3])来抑制靶的转录。另外,抗雄激素物质还可以通过干扰下丘脑-垂体-轴上的某些环节(如,雄激素的合成、分泌、激活、代谢等)来发挥抗雄激素作用,例如:MaitraSK等[5]研究表明,甲基对能降低下丘脑生的毒效应[6],包括协同作用、简单相加、拮抗作用。研究表明,相比于在一种化合物下,同时或者先后于同类化合物下可能引起更高或者更低的联合作用[7]。但是,目前95%的毒理学研究是针对单种化学物质的[8],对近年来,邻苯二甲酸酯类物质(Phthalateesters,PAEs)的内分泌干扰作用phthalate,DEHP)和邻苯二甲酸二丁酯(Dibutylphthalate,DBP)的使用量占增面都被广泛应用[10-11]。2012年和2013年发生塑化剂和大陆白酒检出塑化剂,这两种物质是主要检出物质,其毒性和健康风险备受关注。已有研究表明,DEHP、DBP具有不同程度的神经毒性、生殖毒性、发育毒性、免用[15-18]因此在蔬菜、水果的生产过程中应用广泛。VZ的代谢产物半衰期较长,农业但上述三种物质联合时的的抗雄激素作用模式尚不清楚。本研究针对第一部分DEHP、DBP、 抗雄激素作用剂量-反应关系研进入食品已成为不争的事实。邻苯二甲酸酯类物质(如DEHP、DBP(VZ)EDCs在多种食品中均有检出[21]。现有研究表明,DEHP、DBP、VZ均表现出的内分泌干扰作用[22-26],并且均是明确的具有抗雄激素作用的外对特定靶及作用终点有相同的影响,如抑制雄性大鼠雄激素依赖性组织器观察到有害作用剂量水平(Noobservedeffectlevel,NOAEL)进行剂量组合,水平(Lowestobservedadverseeffectlevel,LOAEL)或者特定水平的基准反应 BMDL的方法,较传统的NOAEL更科学[29]。本研究参照经济合作与发展组织试验指南(OECDTG441)[30],通过HershbergerDEHP、DBP、VZ的抗雄激素作用,分别确定其抗雄激素作用的毒性参考值NOAEL/LOAEL,同时利用基准剂量法分别分析其剂量-反应关系,并获得BMD和BMDL。为探讨DEHP、DBP和VZ的联合作用研材料与方试剂与仪(FlutamideFTPropionateTP科技;金龙鱼玉米胚芽油,购于丰益贸易(中国)私人;血(Testosterone,T1于华阜物。低速高速离心机,购于东南仪诚设备;XH-6080伽马BS423S电子天平,购于赛多利斯科学仪器()。1-1Table1-1Ingredientsofsoy-and 含量玉米面(ground 小麦粉(ground 60%(fs 粗小麦(wheat 酪蛋白(casein 脱脂奶粉(driedskim (corn 玉米油(corn 酵母(brewers (choline 试验动SPF级6SpragueDawley(SD)雄性大鼠共168只(通过3批试验完成,每批次56只,体重190-210g,购于维通利华实验动物技术[生产证:SCXK(京)2012-0009],饲养于中国疾病预防控制中心动物实验室[实验动物证号:SYXK(京)2009-0032]饲养条件:温度为20-24℃、40-70%15-20LX、换气次数≥15次/h、12h昼夜交替、空气清洁度7级、噪声dB(A)≤60。方SD3天,确保用于实验的动物活动、生长正常,然后进行去势手术(通常SD大鼠在出生后前42d与没有完全分离,所以去势手术要在地42d或之后进行[30。手术前先腹腔注射2%的戊巴比妥钠剪开一道小切口,用血管结扎的方法摘除和,此外还要切除。动物止血后用擦洗切口,并用缝合针缝合阴囊。手术工具全部提前处18组(7:5ml/kgbw(下同每批阳性对照组(Positivecontrol,PC)13mg/kgbwFT;分别灌胃给予6、12、25、50、75、100mg/kgbw的VZ;各组大鼠灌胃前30min均皮射0.2mg/kgbw的TP(皮射量0.5ml/kg10d242只/24h2%戊巴比妥钠麻醉。待大鼠进入麻醉状态后,将其解剖,经腹主动脉采血后,取5个雄激素依赖:阴
×1.3.3睾酮、生成素检1.3.4蜡,分别用梯度95%、90%、80%、70%浸泡后用蒸馏水冲洗,使用苏木统计分析实验结果以̅±sSPSS19.0软件进行单因素方差分析(One-wayANOVADunnettDunnett’sT3法,检验水准α=0.05,P<0.05为差异有统计学意义。使用基准剂量软件(Benarkdoessoftware,BMDS)2.6.0中文版(国家食品安全风险评估中心)分别拟合DEHP、DBP、VZ对雄激素依赖性组织重参照欧洲食品安全局(EuropeanFoodSafetyAuthority,EFSA)和环保署(EnvironmentalProtectionAgency,EPA)BMD规程,确定数据的纳入/排除水准设为0.05(即当剂量-反应关系检验P1<0.05时,则存在明显的剂量-反应关系)2)[32,33]。选择合适的基准反应 arkresponse,BMR)类量,BMDS给出的默认BMR类型为标准差(Standarddeviation,SD)[33]。依据指标性质(连续型变量/分类变量,选择适宜模型。本实验数据均为连续型变量,可选的五种模型分别为:指数模型(xponntilmoel、希尔模hillmdl(linrmodl(Polnolmodl幂模型(pormodel。将每项指标的各剂量组均值、标准差和样本量纳入模0.0(2,接受模型[]。当每项指标的模型拟合结果中有两个以上模型的拟合优度检验P20.10时,使用最小信息量准则(Akaikeinformationcriterion,AIC)选择最优模型,即选用AIC值最小的模型。Hershberger试验,如果剂量组中两个或两个以上的组织重量出现选择使得两个指标出现显著减少的BMD和BMDL作为抗雄激素作用的参考剂结一般观察和动物体重DEHP受试物批各组大鼠在受试前、受试后体重以及各组增重间差异均无统计学意义(P>0.05。结果见表1-2。 NC35mg/kgbw70mg/kgNC35mg/kgbw70mg/kgbw150mg/kgbw250mg/kgbw500mg/kgbw1000mg/kgbwPC方差分析统计量F(F0 计学意义(P>0.05。结果见表1-3。 NC70mg/kgbw150mg/kgNC70mg/kgbw150mg/kgbw250mg/kgbw500mg/kgbw750mg/kgbw1000mg/kgbw 方差分析统计量F(F0 VZ(P>0.05 NC6mg/kgbw12NC6mg/kgbw12mg/kgbw25mg/kgbw50mg/kgbw75mg/kgbw100mg/kgbw 方差分析统计量F(F0 雄激素依赖性组织的重量及比DEHP腹侧、肛-肌、球腺表现敏感,在250、5001000mg/kgbwNC组比较,差异具有统计学(P<0.05少才显示有统计学意义(P<0.05。详见表1-5。表1-5DEHP对大鼠雄激素依赖性组织重量(mg)的影响(x̅±s,n=Table1-5TheinfluenceofDEHPonandrogen-dependenttissuesweightsof肛-海头NC35mg/kgbw70mg/kgbw150mg/kgbw250mg/kgbw500mg/kgbw1000mg/kgbw 方差分析统计量注:F0表示与对照组相比(P<0.05腹侧和次之,在750和1000mg/kgbw剂量组的重量低于有统(P<0.05(P>0.05见表1-6。 TheinfluenceofDBPonandrogen-dependenttissuesweightsof肛-海头NC70mg/kgbw150mg/kgbw250mg/kgbw500mg/kgbw750mg/kgbw1000mg/kgbw 方差分析统计量 、肛-肌、球腺比较敏感,与对照组相比(P<0.05(P<0.05头最不敏感,在50、75和100mg/kgbw剂量组头重量的降低才有统计学意义(P<0.05。见表1-7。 TheinfluenceofVZonandrogen-dependenttissuesweightsof 腹侧 NC6mg/kgbw12mg/kgbw25mg/kgbw50mg/kgbw75mg/kgbw100mg/kgbw 方差分析统计量注:F005(7,48)=2.21,a表示与对照组相比DEHPNC组相比,DEHP150mg/kgbw剂量组肝脏系数开始升高,有(P<0.05(r=0.875P<0.05(P<0.05(P>0.05 肝脏肾脏肾上腺NC35mg/kgbw肝脏肾脏肾上腺NC35mg/kgbw70mg/kgbw150mg/kgbw250mg/kgbw500mg/kgbw1000mg/kgbw 注:F005(7,48)=2.21,a表示对照组相比DBP在 mg/kgbw剂量组肝脏系数、肾脏系数均高于NC组,(P<0.05(r0.542P0.05(P>0.05 肝脏肾脏肾上腺NC70mg/kgbw肝脏肾脏肾上腺NC70mg/kgbw150mg/kgbw250mg/kgbw500mg/kgbw750mg/kgbw1000mg/kgbw 注:F005(7,48)=2.21,a表示对照组相比无统计学意义(P>0.05。见表1-10。 肝脏肾脏肾上腺NC6mg/kgbw肝脏肾脏肾上腺NC6mg/kgbw12mg/kgbw25mg/kgbw50mg/kgbw75mg/kgbw100mg/kgbw 注:F005(7,48)=2.21,a表示对照组相比雄激素依赖性组织的病理变为方便表述,下列各病理中的A、B、C、D、E部分分别表示头、腹侧、、肛-肌和球腺。实验的NC组各脏器均未表现出任何病理学改变,见图1-1。图1-1NC组各雄激素依赖性组织的病理Figure1-1Histopathologicalfigureofandrogen-dependenttissuesofSCNC组相比,DEHP、、mg/kgbw剂量组各雄激素依赖性组织器官均未见明显的病理学改变;、、mg/kgbw剂量组腹侧部分腺体萎缩,肛-肌局灶性萎缩,上皮细胞轻度萎缩,而头和球腺均未见明显的病理学改变。详见图1-2至图1-4。Figure1-2HistopathologicalofchangesDEHP250mg/kgbwgroupandrogen-dependentFigure1-3HistopathologicalofchangesDEHP500mg/kgbwgroupandrogen-dependentFigure1-4HistopathologicalofchangesDEHP1000mg/kgbwgroupandrogen-dependentNC组相比,DBP、、mg/kgbw剂量组各雄激素依赖性组织器官均未见明显的见病理学改变;500mg/kgbw剂量组肛-肌出现局灶性萎缩,其他组织未见明显的见病理学改变;、mg/kgbw剂量组Figure1-5HistopathologicalofchangesDBP500mg/kgbwgroupandrogen-dependentFigure1-6HistopathologicalofchangesDBP750mg/kgbwgroupandrogen-dependentFigure1.7HistopathologicalofchangesDBP1000mg/kgbwgroupandrogen-dependentVZNC组相比,6、12、25mg/kgbw剂量组各雄激素依赖性组织均未见明显的见病理学改变;50mg/kgbw剂量组头皮肤和角化小刺减少,腹侧轻度萎缩,其他组织未见明显的见病理学改变;75、100mg/kgbw剂量组头皮肤和角化小刺减少,腹侧、、尿道球腺出现萎缩,头未见明显的见病理学改变。详见图1-8至图1-10。图1-8VZ50mg/kgbw组对各雄激素依赖性组织的病理影Figure1-8HistopathologicalofchangesVZ50mg/kgbwgroupandrogen-dependent图1-9VZ75mg/kgbw组对各雄激素依赖性组织的病理影Figure1-9HistopathologicalofchangesVZ75mg/kgbwgroupandrogen-dependent图1-10VZ100mg/kgbw组对各雄激素依赖性组织的病理影Figure1-10HistopathologicalofchangesVZ100mg/kgbwgroupandrogen-dependentBMDS,与腹侧、、肛-肌、球腺重量之间存在剂量-反应关(P1<0.05,=0.09最适合DEHP与腹侧重量(P2=0.62,AIC=341.2)的剂量-反应关系的拟合;幂模型最适合DEHP与重量(P2=0.12,AIC=447.2)的剂量-反应关系 AIC=475.0道球腺重量(P2=0.36,AIC=222.0)的剂量-反应关系的拟合,详见表1-11。图1-11展示经拟合优度检验之后,各个纳入指标的剂量-反应关系曲线图。表1-11DEHP对雄激素依赖性组织重量的剂量-反应关系曲线拟合优度检验Table1-11Goodnessoffittestresultsofben arkmodelingforDEHPonandrogen-dependenttissuesweightsofrats0.69216.00.62380.640.320.69216.00.62380.640.32475.00.36222.00.680.570.210.680.580.570.12447.20.21注:a表示模型的拟合优度检验P2>0.10;b表示通过拟合优度检验的模型中最小的A:指数模型拟合DEHP与腹侧重量的剂量-反应关系曲线B:幂模型拟合DEHP与重量的剂量-反应关系曲线C:模型拟合DEHP与肛-肌重量的剂量-反应关系曲线D:模型拟合DEHP与球腺重量的剂量-反应关系曲线 BMDS拟合DEHP对大鼠雄激素依赖性组织重量影响的剂量-反应关Figure1- Dose-responsecurvesforDEHPonandrogen-dependenttissuesbyBMDBMDL,详见表1-12,腹侧、、肛-肌、球腺四个重量指标所对应的-BMD和BMDL均不同,其中 肌重量对应的BMD和BMDL最小-同BMD=198.59mg/kgbwBMDL=150.38mg/kgbwDEHP最合适的表1-12DEHP对雄激素依赖性组织重量影响的BMD和Table1-12BMDandBMDLvaluesforsuitablemodelofDEHPonandrogen-dependenttissuesweightsofrats(重量 (mg/kg(mg/kg腹侧指数模 肛- DBP对雄激素依赖性组织重量影响的剂量-反应关系分剂量-反应关系检验结果显示DBP与头、腹侧、肛(P1<0.05,腹侧、、肛-肌、球腺重量指标均纳入到DBP毒性BMD1.13。模型拟合优度检验结果显示,指数模型最适合DBP与头(P2=0.79,AIC=212.6、肛-肌重量(P2=0.76,AIC=423.8)的剂量-反应关系的拟合;模型最适合DBP与腹侧(P2=0.99,AIC=336.6、(P2=0.29,AIC=458.7、球腺重量AIC=219.9)的剂量-反应关系的拟合,见表1-13。图1-12展示经拟合有度检验 arkmodelingforDBPonndrogen-dependenttissuesweightsof arkmodelingforDBPonndrogen-dependenttissuesweightsof 腹侧肛-肌 0.79212.60.570.110.7649212.60.570.110.76450.99336.60.29458.70.680.41219.90.790.570.120.720.140.790.570.720.140.790.430.720.14A:指数模型拟合DBP与头重量的剂量-反应关系曲线B:模型拟合DBP与腹侧重量的剂量-反应关系曲线C:模型拟合DBP与重量的剂量-反应关系曲线D:指数模型拟合DBP与肛-肌重量的剂量-反应关系曲线E:模型拟合DBP与球腺重量的剂量-反应关系曲线 Figure1- Dose-responsecurvesforDBPonandrogen-dependenttissuesby头、腹侧、、肛-肌、球腺四个重量指标所对应的BMD和BMDL均不同,其中球腺重量对应的BMD和BMDL最小,分别为384.08和261.78mg/kgbw;肛-肌重量对应的BMD和BMDL次之,分别为406.65276.78mg/kgbwBMD=406.65mg/kgbw、BMDL=276.78mg/kgbw定为DEHP最合适的抗雄激素作用参考剂量值。表1-14DBP对雄激素依赖性组织重量影响的BMD和 BMDandBMDLvaluesforsuitablemodelofDBPonandrogen-dependent (重量 (mg/kg(mg/kg 腹侧模 型 肛- VZ对雄激素依赖性组织重量影响的剂量-反应关系分析剂量-反应关系检验结果显示VZ与头、腹侧、、肛(P1<0.05,腹侧、、肛-肌、球腺重量指标纳入到VZ毒性试验与头(P2=0.95,AIC=212.2、腹侧(P2=0.30,AIC=345.8、(P2=0.44,AIC=433.7、肛-肌(P2=0.95,AIC=419.5、球表1- BMDS分析VZ对雄激素依赖性组织重量的剂量-反应关系曲线拟合优度检Table1-15benarkmodelingforVZonandrogen-dependenttissuesweightsof头肛-0.95212.20.30345.80.44433.70.95419.50.80221.80.680.680.68注:a表示模型的拟合优度检验P2>0.10;b表示通过拟合优度检验的模型中最小的A:模型拟合VZ与头重量的剂量-反应关系曲线B:模型拟合VZ与腹侧重量的剂量-反应关系曲线C:模型拟合VZ与重量的剂量-反应关系曲线D:模型拟合VZ与肛-肌重量的剂量-反应关系曲线D:模型拟合VZ与球腺重量的剂量-反应关系曲线 Figure1- Dose-responsecurvesforVZonandrogen-dependenttissuesbyBMDBMDL,详见表1-16。头、腹侧、、肛-肌、球腺四个重量指标分别为4.36和2.37mg/kgbw;球腺重量对应的BMD和BMDL次之,分7.993.50mg/kgbwBMD=7.99mg/kgbw、BMDL=3.50mg/kgbw定为DEHP最合适的抗雄激素作用参考剂量值。 VZ对雄激素依赖性组织重量影响的BMD和 BMDandBMDLvaluesforsuitablemodelofVZonandrogen-dependent(重量头肛肌讨Hershberger试验通过雄性大鼠去势的方法,使大鼠体内内源性雄激素水平降到最低,并尽可能的减少内源性雄激素的差异,去势后的大鼠经过的增加会相对一致。因此筛检具有抗活性的化学物质时,先通过皮目前检测抗雄激素的最有效的筛检方法[34。本课题组以FT为阳性物的Hershberger试验,如果剂量组中两个或两个以上的组织重量出现准为指导,分别对DEHP、DBP和VZ的抗雄激素作用展开讨论。DEHPDBP的抗雄激素作行同一讨论。同时,可对DEHP和DBP抗雄激素作用的强度进行比较。期启动时限明显延迟,并引起细胞、支持细胞和间质细胞的功能,干DeIuliisGN等[36]研究表明雄性成年小鼠对高剂量PAEs的会产生快速而严重的损伤,表现为重量减轻和小管的萎缩,小管的萎缩伴质量减轻等效应,高剂量的DEHP会导致的组织生理学改变。以上研究结果均提示了DEHP、DBP抗雄激素作用的潜在机制。本研究发现DEHP和DBP可显著影响肛-肌、球腺、腹侧重量,说有研究表明DEHP 是通过雄激素受体非依赖性机制诱导抗雄激素作用[39]DEHPDBP可能通过干扰雄激素转运或者改变Byung[40]研究表明,DEHP的抗雄激素作用强于DBP,本研究也说明了这一点。本研究结果显示,DEHP250mg/kgbw时,对模型大鼠的腹侧、肛-肌、球腺产生显著抑制作用,并且存在剂量-反应关系;DBP剂量达到500mg/kgbw时,对模型动物的肛-肌、尿道球腺产生抑制作用,剂量上升到750mg/kgbw时,腹侧和也产生的反应较为敏感,次之,头反应最不敏感。早有研究表明肛肛-肌和两个靶可以用于内分泌干扰作用机制的研究。另外,本实验结果显示,DEHP150mg/kg.bw及以上时,大鼠肝脏器系数显著高于对照,剂量为500mg/kg.bw及以上时,大鼠肾脏器系数也显著高于对照;DBP500750mg/kg.bw时也分别表现为肝和肾脏器系数增加。综合DEHP和DBP对5个雄激素依赖性组织的作用结果表明,DEHPDBP250mg/kgbw、500mg/kgbw剂量组表现出了抗雄激素作用,即DEHPDBPLOAEL250500mg/kgbw,相应的NOAEL值分别150mg/kgbw250mg/kgbw。综BMD分析结果表明,DEHPDBPBMDL10150.38276.78mg/kgbw。VZ多项研究发现VZ有干扰生物体内分泌系统的作用,并且被列入到国家环境保护局(USEPA)2009年公布的饮用水污染物候选[46]和欧盟优先污染物[47]。GrayLE等[48]研究发现,胚胎期于VZ可以干扰哺乳动物的分化本研究发现DEHP和DBP可显著影响、球腺、肛-肌、腹侧以及头重量,也印证了VZ的抗雄激素作用。酰基]氧基}-2-甲基-3-丁烯酸(M1)和2-(3,5-二氯苯基)-2-羟基-2-甲基-3-丁烯酰胺(M2)[52]。体外实验显示M1M2ARAR的正是一种典型的AR受体拮抗剂。本研究结果表明,12mg/kgbw及以上VZ剂量组,对模型大鼠的肛-肌、球腺和产生显著抑制作用,并且存在剂量-反应关系;25mg/kgbw及以上VZ剂量组的腹侧重量显著低于对照,50mg/kgbw及以上VZ剂量组的头重量也显著低于对照。从靶敏感度来看,、NOAEL6mg/kgbw,LOAEL12mg/kgbwBMD分析结果表明,VZ的抗雄激素作用BMDL10值为3.50mg/kgbw。相近,但BMD法充分利用了所有的剂量-反应资料并且通过BMDL10来说明数在LOAEL剂量(250mg/kgbw)下,对肛-肌、球腺重量产生阳性效应;DBP在LOAEL剂量(500mg/kgbw)下,对肛-肌、尿道球腺腹侧重量产生阳性效应;VZ在LOAEL剂量(12mg/kgbw)下,小DEBP、DBPVZSD大鼠雄激素依赖性组织器体肌、球腺重量为三种物质作用的共性敏感指标。结合BMD分析法明确了DEBP、DBP和VZ与靶指标间的剂量-反应关系,并确定了各自抗雄激素作500和12mg/kgbwDEBPDBP和VZ抗雄激素作用的BMDL10分别为:150.38第二部分DEHP、DBP、 抗雄激素作用联合作用模式研EDCs的研究重要针对单体化合物,而这些资料很难阐明多种EDCs共同所带来的健康风险问题。有研究表明,作用模式相同或者相似的化学物质同时于一个环境中,对每一种单独的物质进行研究和健康学评价是有问题的[54]。相比于于一种化合物下,同时或者先后暴展EDCs联合作用模式方面的研究。环境中存在的EDCs含量普遍较低,因此本章根据第一部分得出的DEHP、DEHP、DBPVZLOAEL进行联合作用的实验设种方法探究三种受试物的抗雄激素联合作用模式,为进一步研究EDCs联合作材料与方试剂与仪DEHP、DBP、VZ、FT,均购自奥()贸易;私人;去豆类成分饲料(配方[31]见表1-1),购于华阜物科。低速高速离心机,购于东南设备;XH-6080伽马BS423S电子天平,购于赛多利斯科学仪器()。试验动SPF级6SpragueDawley(SD)雄性大鼠共56只,体重190-210g,饲养于中国疾病预防控制中心动物[实验动物证号:SYXK(京)换气次数≥15次/h、12h昼夜交替、空气清洁度7级、噪声dB(A)≤60。方SD3天,确保用于实验的动物活动、生长正常,然后进行去势手术,具体操作见第一部分1.3.1。将三种受试物进行充分联合分组,联合方式及剂量见表2-1。将各组受试物(或联合受试物)用玉米油溶解为相应浓度的溶液。各组均皮射0.2mg/kgbw的TP(皮射量为0.5ml/kg,30min后,各组灌胃给予相应浓度的受试物(或联合受试物)10d24小时称重且记录,并以体重调整灌胃量。试验期间2只/笼饲养,饲喂以去豆类成分饲料。 DosecombinationofDEHP、DBP、组 联合剂量(mg/kgNC 玉米A组 B组 C组 D组 E组 F组 G组 24h2%戊巴比妥钠麻醉。待大鼠进、腹侧、、肛-肌、球腺,以及肝脏、肾脏、肾0.001g,林溶液中固定。计算肝脏、肾脏、肾上腺的脏器系数,脏器系数为:
×统计分析实验结果以̅±sSPSS19.0软件进行单因素方差分析(One-wayANOVADunnettDunnett’sT3法,检验水准α=0.05,P<0.05为差异有统计学意义。2×2×22-2分组处理,三个250mg/kgbw;DBP:500mg/kgbw;VZ:12mg/kgbw。析因设计方差分析纳入的指标:头、腹侧、、肛-肌、球腺五个满足方差齐性后再进行分析,检验水准α=0.05。即,对于主效应,检验结果P<0.05表示相应受试物间存在联 NCDEHP+--DBP-+-VZ--+DEHP+DBP++-DEHP+VZ+-+DBP+VZ-++DEHP+DBP+VZ+++ 由第一部分结果可知,模型是拟合DEHP、DBP和VZ对SD大鼠尿道球腺重量间剂量-反应关系的最优模型(1.6部分,因此,可模型的函数见2-1𝑌̂(𝑑)=γ+V∙𝑑𝑛/(𝑘𝑛+ 上式中,𝑑表示剂量,̂(𝑑)表示𝑑剂量下的预测效应,γ表示截距(即效应V,。代入第一部分中BMD分析所得的参数,可得到DEHP与球腺重量间剂量-反应关系的函数,见2-2。̂(𝑑)𝐷𝐸𝐻𝑃 DEHPDBP、VZ相应的效应值𝑌(𝑑)𝐷𝐵𝑃、𝑌(𝑑)VZ,利用2-32-4将DBPVZ剂量分别转换为等效应的DEHP剂量d𝐷𝐸𝐻𝑃−1和
d𝐷𝐸𝐻𝑃−1
(2-
d𝐷𝐸𝐻𝑃−2
(2-再通过2-5计算出联合作用剂量𝑑联合𝑑联合=𝑑𝐷𝐸𝐻𝑃+𝑑𝐷𝐸𝐻𝑃−1+ 此时的联合作用剂量均以DEHP的形式呈现,最后,将𝑑联合代入2-̂用。由于三种受试物的阳性效应均为降低球腺重量,因此,若预测效应显结一般观察和动物体各组大鼠增重差异均无统计学意义(P>0.05。结果见表2-3。 TheinfluenceofDEHP,DBPandVZonbodyweightchangeof重量NCDEHPDBPVZ275.9DEHP+DBPDEHP+VZDBP+VZDEHP+DBP+VZ注:F005(7,48)=2.21,a表示与对照组相比NC组相比,DEHP组、DEHP+DBP组、DEHP+VZ组、(P<0.05NC组相比,DEHPDBP组、DBPVZ组、DEHPDBPVZ组的肾(P<0.05(P>0.05表2-4DEHP、DBP和VZ对大鼠其他脏器的脏器系数影响(x̅±s,n=7)Table2-4 TheinfluenceofDEHP,DBPandVZonorgancoefficientofrats肝脏肾脏肾上腺NCDEHPDBPVZDEHP+DBP3.98±0.33DEHP+VZ4.14±0.36DBP+VZ方差分析统计量注:F0表示与对照组相比联合作用的析因设计方差分析结头、腹侧、、肛-肌、球腺重量的原始数据见表2-5。对原始数据进行方差齐性检验,结果表明肛-肌数据方差(P=0.01(P>0.05(P=0.33 TheinfluenceofDEHP,DBPandVZonandrogen-dependenttissuesweightsof 腹侧 NCDEHPDBPVZDEHP+DBPDEHP+VZDBP+VZDEHP+DBP+VZ
Testresultsofhomogeneityofvariancesforeach
主效应检验结果表明 对腹侧、球腺重量存在主效(P<0.05;DBP(P<0.05;VZ对头、腹侧、、肛-肌、球腺重量均存在主效应(P<0.05 Table2-7ResultsoffactorialysisforthyroidrelatedendpointsofratstreatedwithcombinationofDEHP,DBPandVZ FFPFPFPFPFPDEHPDBPVZDEHP+DBPDEHP+VZDBP+VZDEHP+DBP+VZ- (P<0.01-DEHP+DBP影响肛-肌重量的联合作用轮廓图,见图2-1(A),显示(P>0.05见表2-7。DEHP和VZ联合染毒对5个雄激素依赖性组织影响均表现为简单相加作用(P>0.05。详见表2-7。的影响存在联合作用(P<0.01,DBP+VZ4种雄激素依赖性组织2-1(B)-2-1(E))均显示两条直线相互靠近甚至相交,单相加作用(P>0.05。详见表2-7。DEHP、DBP和VZ联合染毒对5个雄激素依赖性组织影响均表现为简单相加作用(P>0.05。详见表2-7。A:DEHP+DBP影响肛-肌重量的
B:DBP+VZ影响头重量的联合作用轮廓C:DBP+VZ影响腹侧重量的联合作用
D:DBP+VZ影响肛-肌重量的联E:DBP+VZ影响球腺重量的联合作用轮廓图2-1联合作用轮廓图Figure2- profileof ction218.6mg/kgbw258.3mg/kgbw。详见表2-8。表2-8通过模型对DBP和VZ的剂量转换结果(mg/kgbw)Table2-8TransformedDEHPdosesofDBPandVZbasedonHillmethodDBP(mg/kg VZ(mg/kg等效DEHP等效DEHP如此以DEHP剂量表示,DEHP+DBPDEHP+VZDBP+VZ、DEHP+DBP+VZ组的联合剂量分别为468.6508.3476.9726.9mg/kgbw。24.7、24.4mgt检验结果显示:DEHP+DBPDBP+VZ组的实际(P=0.02P<0.01DEHP+VZ组和DEHP+DBP+VZ组的实际效应与预测效应相比,差异均无统计学意义(P>0.05为拮抗作用,DEHP+VZ、DEHP+DBP+VZ两种联合方式的作用模式均表 ComparisonsbetweenpredictionandtestedresultswithDEHP,DBPand(mg/kg(P值DEHP+DBPDEHP+VZDBP+VZ讨脏器系数来看,DEHP在LOAEL剂量单独中只有肝脏系数显著高于对(P<0.05而DBP、VZ在LOAEL剂量单独中肝脏、肾脏和肾上腺系数对雄激素依赖性组织影响的联合作用效果。本试验是以第一部分获得的DEHP、DBPVZ抗雄激素作用的LOAEL为基础进行析因设计,研究不同受试物间的联合作用,三种物质的LOAEL分bw(DEHPbw(VZ析因设计方差分析,以5个雄激素依赖性组织为终点分别分析联合作用模系曲线形状大致相同[56],而利用BMDS拟合DEHP、DBP和VZ对球腺重DBP和VZ作用影响最敏感的指标之一。联合作用模式的判联合作用分析结果显示,DEHP和DBP联合对肛-肌的影响表现为拮抗作用,对其他雄激素依赖影响均表现为简单相加作用。这种差别反映到指标上可能是敏感性的不同,第一部分实验结果显示,肛-海绵体肌是对DEHP、DBP抗雄激素作用反应最为敏感的指标之一(详见第一部1.2DEHPDBP的联合作用反应较其他指标更加敏感。文献显示,DEHP、DBP的抗雄激素作用机制有相似之处[38,40],以至于在发挥抗雄激素作用中存在某些竞争性拮抗,因此拮抗作用很可能是DEHP和DBPDBP和VZ联合作用方差分析结果显示,对头、腹侧、肛-肌、球腺的影响均表现出拮抗作用。第一部分3.1部分讨论过DBPVZAR拮抗的方式产生雄激素作用[52],两者的作用机制可能存在连詹宁育等[59]研究辛和戊菊酯对大鼠的联合作用,在低剂量和高剂量本试验以球腺为效应终点进行“剂量相加法”分析,结果显示DEHP和小本章节的研究利用“析因设计方差分析法”和“剂量相加法”DEHP、DBP和VZ对5各雄激素依赖性组织影响的联合作用,析因设计方差分析结果表明:DEHP和DBP联合染毒对肛-肌的影响表现为拮抗作用,对头、腹侧、、球腺的影响表现为简单相加作用;DEHP和VZ联合染毒对5个雄激素依赖性组织影响均表现为简单相加作用;DBP和VZ联合染毒对头、腹侧、肛-肌、球腺的影响均表为拮抗作用,对的影响表现为简单相加作用;DEHP、DBP和VZ联合染毒对5个雄激素依赖性组织影响均表现为简单相加作用。“剂量相加法”分析结果:以球腺为作用终点的联合作用模式为拮抗作用。由于受不同受DEBP、DBPVZSD大鼠具有抗雄激素作用,与靶指标间存在明显的剂量-反应关系,其中肛-肌和球腺对此作用反应最为敏感。DEBP、DBPVZNOAEL分别为:150、2506mg/kgbwDEBPDBP和VZ抗雄激素作用的LOAEL分别为:250500和12mg/kgbw;DEBP、DBPVZBMDL10分别为:150.38、276.78和3.50mg/kgbw。DEBP、DBP和VZ同时,对SD大鼠抗雄激素作用模式主要表现为拮朱威,朱心强.的抗雄激素作用及其机制[J].国外医学卫生学分册32(1):14-ChangCY,McDonnellDP.Androgenreceptorcofactorinctionsastargetsfornewdrugdiscovery[J].TrendsPharmacolSci,2005,26(5):225-228.HeemersHV,TindallDJ.Androgenreceptorcoregulators:adiversityoffunctionsconvergingonandregulatingtheArtranscriptionalcomplex[J].EndocrRev,2007,28(7):778-808.KelceWR,LambrightCR,GrayLeJr,etal.Vinclozolinandp,p'-DDEalterandrogen-dependentgeneexpression:invivoconfirmationofanandrogenreceptor-mediatedmechanism[J].ToxicolApplPharmacol,1997,142(1):192-200.MaitraSK,MitraA.TesticularTesticularTesticularTesticularfunctionsand 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