第十五章：免疫细胞标志和功能检测技术培训课件

第十五章

免疫细胞标志和功能检测技术

目录第一节免疫细胞的分离第二节淋巴细胞标志及亚群分类第三节抗原提呈细胞的表面标志第四节淋巴细胞的功能检测第五节其它免疫细胞功能检测技术第六节免疫细胞表面标志和功能检测的临床应用第一节免疫细胞的分离重点提示外周血单个核细胞分离淋巴细胞的分离T、B细胞和T细胞亚群的分离细胞分选和基本原理细胞分选和基本原理不同细胞密度不同不同细胞表面生物学特性不同不同细胞表面分化抗原不同白细胞分离-自然沉降法白细胞分离-自然沉降法外周静脉血，静置，血液分3层:上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，紧贴红细胞层上面的灰白色层为白细胞和血小板。

白细胞分离-高分子聚合物沉降法

1.明胶沉降法

2.右旋糖酐法红细胞凝集沉降不同细胞密度不同人的红细胞密度为1.093粒细胞密度为1.092单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为1.076-1.090细胞密度血小板1.030～1.035淋巴细胞1.075～1.090粒细胞1.092红细胞1.093用1.077±0.001的分层液可将细胞分离密度梯度离心(Ficoll)离心细胞表面分化抗原（CD抗原）适用于T、B细胞的分离已知CD抗原细胞亚群的分离未知CD抗原细胞亚群的分离（阴性分选）不同细胞谱系，不同细胞分化阶段，细胞表面CD抗原不同磁珠大小可以选择免疫磁珠法细胞分选过程免疫磁珠法细胞分选过程荧光激活细胞分离仪分离法E花环分离法E花环分离法CD2绵羊红细胞受体尼龙棉柱分离法尼龙棉柱分离法PBMCB细胞、单核细胞T细胞补体细胞毒法利用免疫细胞表面的某种抗原与相应抗体结合，加入补体，借助补体介导的细胞毒作用，将拟剔除的抗原阳性细胞破坏，收集未被破坏的抗原阴性细胞而达到免疫细胞分离的目的。

亲和板结合分离法利用免疫细胞表面的某种抗原与相应抗体结合，加入补体，借助补体介导的细胞毒作用，将拟剔除的抗原阳性细胞破坏，收集未被破坏的抗原阴性细胞而达到免疫细胞分离的目的。

亲和板结合分离法第二节淋巴细胞标志及亚群分类

一、Ｔ细胞表面标志及亚群

CD3+CD4+CD8-辅助性Ｔ细胞（helpTcell,Th）CD3+CD4-CD8+细胞毒性Ｔ细胞（cytotoxicTcell,TcorCTL）CD4+CD25+Foxp3+调节性Ｔ细胞（regulatoryTcell,TrorTreg）二、B细胞表面标志

CD19、CD20、CD21、CD22和CD23等。以CD5为标志结合CD19或CD20可将B细胞分为B1（CD19+CD5+）和B2(CD19+CD5-)两个亚群。三、NK细胞表面标志

NK细胞表面至少存在CD2、CD16、CD56、CD69、CD94、CD96、CD158a、CD159a、CD161和CD244等多种抗原。目前多以CD3-、CD16+、CD56+作为NK细胞的典型标志。第三节抗原提呈细胞的表面标志抗原提呈细胞的表面标志

单核-吞噬细胞的典型的表面标志是CD14。人成熟DC的主要特征表面标志为CD1a、CD11c和CD83，但不表达单核-吞噬细胞、T细胞、B细胞和NK细胞的典型的表面标志。第四节淋巴细胞的功能检测T淋巴细胞增殖试验原理：淋巴细胞DNA合成分化母细胞刺激物细胞变大细胞浆扩大核染色质疏松核仁明显2.淋巴细胞转化的刺激物非特异性刺激物：PHA------T细胞ConA-------T细胞PWM-------T、B细胞LPS-------B细胞特异性刺激物：异种抗原同种组织抗原

一、形态学法3H-TdR掺入法SI（刺激指数）=PHA刺激管cpm均值/对照管cpm均值MTT比色法淋巴细胞增殖时，摄取MTT，MTT被线粒体琥珀酸脱氢酶还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲臜，沉积于细胞内或细胞周围，其生成量与细胞增殖水平呈正相关。SI=试验孔A570nm均值/对照孔A570nm均值抗原特异性T细胞增殖试验可溶性抗原肽-MHC四聚体复合物法MHC-肽四聚体技术抗原特异性T细胞增殖试验可溶性抗原肽-MHC四聚体复合物法MHC-肽四聚体技术T细胞介导的细胞毒试验1.形态学检查法

待检T细胞与相应的靶细胞混合共育后，以瑞氏染液染色，用显微镜计数未被破坏的肿瘤细胞数，判断效应细胞的杀伤能力。

T细胞介导的细胞毒试验2.51Cr释放法

体内试验特异性抗原皮肤试验PHA皮肤试验第五节其它免疫细胞功能检测技术一、趋化功能检测1．琼脂糖平板法

趋化指数=A’/B’A’B’2.滤膜渗透法（Boyden小室法）二、白细胞吞噬功能的检测三、杀菌能力的检测白细胞＋菌液37℃培养定时取定量菌液培养计算菌落数四、氮唑蓝(NBT)还原试验中性粒细胞杀菌时耗氧量增加葡萄糖6-磷酸→戊糖↑原理：NBT→蓝黑色甲臜颗粒磷酸乙糖旁路代谢活力增强H+↑操作抗凝血+NBT应用液温育推片瑞士复染五、巨噬细胞功能检测(一)炭粒廓清试验正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90%炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除10%炭粒。据此给小鼠定量静脉注射印度墨汁(炭粒悬液)，间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，判断巨噬细胞的功能。(二)吞噬功能检测巨噬细胞对颗粒性抗原物质具有很强的吞噬功能，常用鸡红细胞(CRBC)、白色念珠菌、酵母细胞等作为吞噬颗粒，用斑蟊敷贴法收集人巨噬细胞或从腹腔渗出液获得鼠巨噬细胞。

第六节免疫细胞功能检测的临床应用反映机体免疫功能状态。肿瘤、免疫缺陷病等疾病的诊断和疾病预后监测。组织器官移植后对受者的细胞免疫学功能监测则有利于排斥反应的早期发现，以便及时采取有效措施。本章小结淋巴细胞并不是功能单一的群体，但其在光学显微镜下的形态基本是一样的，因此要对其进行进一步的分类和观察就不能采用形态学的方法，而要依靠对其表面标志的检测。利用细胞表面标志可以实现对各类细胞的计数。本章小结免疫细胞功能试验