实验 细胞融合

实验细胞融合第1页，共14页，2023年，2月20日，星期六

杂交的目的-----制备单克隆抗体

第2页，共14页，2023年，2月20日，星期六杂交瘤技术的基本原理具有分泌功能的B细胞难以在体外长期存活。利用细胞融合技术，将免疫后的B细胞与在体外能长期存活的骨髓瘤细胞进行融合，经过选择培养获取杂交细胞，这种细胞称为杂交瘤细胞（Hybridoma）。※：该细胞的特点：1、具有免疫B淋巴细胞分泌特异性mAb的功能；2、具有骨髓瘤细胞无限增殖的能力。故应用杂交瘤细胞生产单克隆抗体。

第3页，共14页，2023年，2月20日，星期六杂交瘤技术基本过程示意图第4页，共14页，2023年，2月20日，星期六

HAT选择性培养

HAT分别代表次黄嘌呤（hypoxanthine，H）氨基碟呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶（thymidine,T）三种物质。细胞的DNA生物合成有两条途径：第5页，共14页，2023年，2月20日，星期六

ChoiceofanimalThemouseisusuallytheanimalofchoice.Suitablemousemyelomacelllinesarewidelyavailable,andgrownofhybridomasinmiceisusuallynoproblem.Allofthecurrentlyavailablemousemyelomalines,whicharesuitableforfusion,areofBALB/Corigin,6-8week,femalemouseisusuallyused.第6页，共14页，2023年，2月20日，星期六Choiceofmyelomacell

1.NS-1,

hasbeenverywidelyusedforhybridomaproduction.Whenculturedalone,itsynthesizesκlightchains.

2.X63andSp2/0arethecurrentlinesforfusion.Sp2/0hybridomaappeartobesomewhatmoreSensitivethanNS-1toenvironmentalconditions.第7页，共14页，2023年，2月20日，星期六Fusingagent

Allcurrenthybridomaworkusespolyethyleneglycol(PEG)asthefusingagent.TheexactmolecularweightPEGseemstobeunimportant.MostinvestigatorshaveusedPEGofmolecularweight500-6000.NotethatthenumberassignedtoPEGdoesnotnecessarilyindicateitsmolecularweight.concentrationofPEGrangefrom

30%to50%.Below30%,thefusionfrequencyislow,andabove50%,toxicitybecomesoverwhelming.第8页，共14页，2023年，2月20日，星期六动物免疫一、可溶性抗原1wk抗原50μg/只，溶于300μl生理盐水中，加入等量福氏完全佐剂（CFA）充分乳化，分颈、部皮下多点及腹腔注射；3wk抗原的剂量及注射的部位同上，仅将全佐改为半佐（IFA）；5wk抗原50μg/只，溶于300μl生理盐水中，腹腔注射；加强融合前3~5天抗原20~30μg/只，溶于50μl生理盐水中，小鼠尾静脉注射以加强免疫。第9页，共14页，2023年，2月20日，星期六二、细胞抗原1wk细胞数量8×106个/只，洗涤三遍，用0.3~0.4ml的生理盐水重新悬浮，腹腔注射；3wk细胞数量6×106个

/只，细胞的预处理及注射的部位同上；5wk细胞数量5×106个

/只，细胞的预处理及注射的部位同上；加强融合前的4~5天细胞数量3×106个/只，加强免疫。

在以肿瘤细胞作免疫原时，为避免免疫过程中小鼠因生长肿

瘤而死亡。故用丝裂霉素处理免疫原细胞，抑制其生长繁殖

以防形成肿瘤。最后的加强免疫，肿瘤细胞可不经丝裂霉素

处理，因4~5天后即进行融合。第10页，共14页，2023年，2月20日，星期六免疫脾细胞的制备处死小鼠，固定于解剖架上打开腹腔，取出脾脏。置于120目的钢丝网中，将网移入盛有20ml生理盐水的平皿中，用注射针芯轻轻压磨，使其成为单个细胞悬液，吸取1ml细胞悬液（约5×106细胞）,与骨髓瘤细胞SP2/0（5×105细胞）混合，离心后弃上清。※1、骨髓瘤细胞:免疫脾细胞为1:102、一个脾脏可获约108个细胞第11页，共14页，2023年，2月20日，星期六

1、取PEG溶液1.0ml缓慢加入混合细胞中,边加边搅拌；2、静止1分钟；3、加HAT培养基4ml；细胞的融合：第12页，共14页，2023年，2月20日，星期六4、取融合细胞悬液1ml,滴加在96孔培养板中，每孔1滴（约50μl）；5、显微镜下观察融合细胞的状态。第13页，共14页，2023年