单克隆抗体的制备

单克隆抗体的制备原理骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；而抗原免疫的B淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。经在HAT培养基选择性培养下，未融合的B细胞核骨髓瘤细胞不能存活。只有融合的细胞可以存活和增殖。经过克隆选择，可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，在体内或体外培养，即可无限制地大量制备单克隆抗体。制备流程1、抗原制备及免疫程序可溶性抗原（蛋白质）以lmg/m1〜5mg/ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为0.3m1〜0.6m1,间隔3〜5周再同样注射一次,l0天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试验。一个月后可以经静脉（尾静脉）给予无佐剂抗原0.2m1〜0.4m1，3〜4天后，杀死小鼠取脾做融合用。颗粒性抗原如抗原来源方便，可以不加佐剂而增加免疫次数，缩短间隔时间。例如用羊红血球免疫小白鼠，以1%浓度每只皮下注射0.2ml，每周2次，共免疫5〜8次，取脾前3天，再免疫一次即可。有人认为最后一次免疫剂量要大，大到近于免疫耐受的程度更好。2、免疫动物以小白鼠为好。就品系而言以Balb/c小白鼠应用最广，因为所有的小白鼠骨髓瘤系均从Balb/c小白鼠系诱导出来。Balb/c系小白鼠必须用纯系的，雌雄均可，以8~12周龄为宜。免疫程序、剂量和方法是关系到是否能得到所需要的单克隆抗体的关键之一。一般认为加强免疫后的第三天应杀鼠取脾做细胞融合。2、饲养细胞和免疫脾细胞制备（1）饲养细胞：常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞（较为常用）、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞。饲养细胞的量为一般为2x104或105细胞/孔。腹腔渗出细胞的好处是：一方面做饲养细胞，另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片，为融合细胞的生长造成良好的环境。腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同系鼠。（2）制备免疫脾细胞最后一次加强免疫3天后小鼠拉颈处死无菌取脾脏，培养液洗一次脾脏研碎，过细胞筛离心，细胞用培养液洗2次计数取108脾淋巴细胞悬液备用骨髓瘤细胞株可直接从相关单位引进。由于骨髓瘤细胞是半贴壁状态，很容易脱落，因此不需要胰酶处理。为了防止出现返祖现象，在融合前，可将培养基内加入15ixg/ml8—氮鸟嘌吟。取约1X107〜6X107对数生长期（即培养15h〜20h）的骨髓瘤细胞，在室温离心（400g）10min,沉淀以2.5%FCS—1640液再悬浮并计数。3细胞融合将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，离心，1200rpm,8min;弃上清，用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇（PEG）浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。90s内加入37°C预温的1ml45%PEG（分子量4000）溶液，边加边轻微摇动。37C水浴作用90s。加37C预温的无血清培养液以终止PEG作用，每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。离心，500rpm,5min。充上清，用含20%小牛血清HAT选择培养液重悬。将上述细胞，加到已有饲养细胞层的两个24孔培养板中，每孔0.5毫升。一般一个免疫脾脏可接种2块24孔板。⑦将培养板置37°C、5%CO2培养箱中培养。4杂交瘤细胞株的选择每2—3天换一次HAT培养液，连续2周观察杂交瘤细胞是否出现。2周后使用HT培养基。在用HAT选择培养1〜2天内，将有大量瘤细胞死亡，3〜4天后瘤细胞消失，杂交细胞形成小集落，HAT选择培养液维持7〜10天后应换用HT培养液，再维持2周，改用一般培养液。在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间，一般每2〜3天换一半培养液检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。常用的方法有：（1）放射免疫测定（RIA）可用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。（2）酶联免疫吸附试验（ELISA）可用于可溶性抗原、细胞和病毒等McAb的检测。（3）免疫荧光试验适合于细胞表面抗原的McAb的检测。（4）其它如间接血凝试验、细胞毒性试验、旋转粘附双层吸附试验等。杂交瘤细胞的大量繁殖克隆化的细胞可以在体外进行大量培养，收集上清液而获得大量的单一的克隆化抗体。不过体外培养法得到的单克隆抗体有限，其不能超过特定的细胞浓度，且每天要换培养液。而体内杂交瘤细胞繁殖可以克服这些限制。杂交瘤细胞具有从亲代淋巴细胞得来的肿瘤细胞的遗传特性。如接种到组织相容性的同系小鼠或不能排斥杂交瘤的小鼠（无胸腺的裸鼠），杂交瘤细胞就开始无限地繁殖，直至宿主死亡。产生肿瘤细胞的小鼠腹水和血清中含有大量的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，这种抗体的效价往往高于培养细胞上清液的100~1000倍。利用免疫抑制剂，如降植烷、液体石蜡、抗淋巴细胞血清等，可以加速和促进肿瘤的生长。克隆化的方法很多，最常用的是有限稀释法1．有限稀释法克隆（1） 克隆前1天制备饲养细胞层（同细胞融合）。（2） 将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹干，计数。（3） 调整细胞为3〜10个细胞/ml。（4） 取头天准备的饲养细胞层的细胞培养板，每孔加入稀释细胞100”。孵育于37°C、5%CO2孵箱中。（5） 在第7天换液，以后每2〜3天换液1次。（6） 8〜9天可见细胞克隆形成，及时检测抗体活性。（7） 将阳性孔的细胞移至24孔板中扩大培养。（8）每个克隆应尽快冻存。（五）杂交瘤细胞的冻存与复苏1．杂交瘤细胞的冻存细胞冻存液：50%小牛血清；40%不完全培养液；10%DMSO（二甲基亚砜）。冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降至0°c后放入-70C超低温冰箱，次日转入液氮中。2.细胞复苏方法将玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37C水浴中，在lmin内使冻存的细胞解冻，将细胞用完全培养液洗涤两次，然后移入头天已制备好的饲养层细胞的培养瓶内，置37°C、5%CO2孵箱中培养，当细胞形成集落时，检测抗体活性。（六）单克隆抗体的大量生产大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：（1） 体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从一清液中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液内抗体含量为10〜60“g/m如,果大量生产，费用较高。（2） 体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。实体瘤法：对数生长期的杂交瘤细胞按1〜3x107/ml接种于小鼠背部皮下,每处注射0.2m1,共2