高级实验技术实时荧光定量

高级实验技术实时荧光定量2023/4/191第1页，共113页，2023年，2月20日，星期三常规PCR的定量在PCR反应中，理论上扩增产物的量与起始样本中模板的含量成正比。但受多种因素的影响，其精确定量模板的可信度明显不足。2023/4/192第2页，共113页，2023年，2月20日，星期三PCR扩增为指数扩增，每一扩增周期后产物的量可以下式表达：Yn=Yn-1·(1+E)=Yn-2·(1+E)2=…=X·(1+E)n

0≤E≤1其中E表示扩增效率，Yn表示在n个周期后PCR产物的分子数量，Yn-1为n-1个周期后PCR产物的分子数量。2023/4/193第3页，共113页，2023年，2月20日，星期三Realityvs.TheoryAmplificationisexponential,buttheexponentialincreaseislimited:AlinearincreasefollowsexponentialEventuallyplateausTheoreticalRealLifeLogTargetDNA2023/4/194第4页，共113页，2023年，2月20日，星期三影响PCR扩增效率的因素:PCR定量的困难?引物/靶的杂交反应试剂的相对量样本在扩增仪中的位置的不同临床样本中DNA聚合酶抑制物的存在PCR扩增模板的量靶核酸链的再退火及酶过量可致E降低2023/4/195第5页，共113页，2023年，2月20日，星期三定量的最佳时期Quantitativeinformationcomesfrommonitoringtheearlystagesofamplification.RealLifeDetectorTheoreticalLogTargetDNACycle#2023/4/196第6页，共113页，2023年，2月20日，星期三PCR和定量问题

高浓度/高效率

高浓度/低效率

低浓度/高效率

N : 扩增分子的数目n : 扩增循环的次数log-phaseanalysisNnend-pointanalysis2023/4/197第7页，共113页，2023年，2月20日，星期三为克服上述不足，人们设计出包括内标法、外标法、竞争、酶联、尿苷酶降解等多种定量方法。2023/4/198第8页，共113页，2023年，2月20日，星期三内标法在不同的PCR反应管中加入已知量的内标模板和引物，内标模板可由基因工程合成或采用已知量的标准品。在样品模板扩增的同时，内标模板也被扩增。二者的扩增产物可通过电泳或其它方法分离，以内标为对照进行样本模板定量。2023/4/199第9页，共113页，2023年，2月20日，星期三定量PCR

——外标准方法

在扩增检测待测样本的同时，扩增一系列稀释的已知标准（通常为质粒DNA）如果在该标准稀释系列范围内，扩增产物/模板成线性相关，则可推导出同时扩增的待测样本中PCR模板的相对量2023/4/1910第10页，共113页，2023年，2月20日，星期三定量PCR

——外标准方法2023/4/1911第11页，共113页，2023年，2月20日，星期三定量PCR

——外标准方法优点：方法简便，容易建立使用双孔重复测定可得到非常准确的结果甚至可排除管间的差异不能排除样本间的差异2023/4/1912第12页，共113页，2023年，2月20日，星期三定量PCR

——外标准方法缺点PCR反应体系的微小区别也会对测定造成较大的影响在扩增效率上的差异，会使定量测定精密度和重复性不佳2023/4/1913第13页，共113页，2023年，2月20日，星期三使用外标定量的要求必须进行方法的精密度（批内变异）和重复性（批间变异）分析，以确定其应用的局限性必须在扩增的指数期进行2023/4/1914第14页，共113页，2023年，2月20日，星期三竞争法将含有一个新内切酶位点的外源性模板加入PCR反应管中，待测样品模板与外源性模板用同一对引物进行扩增，经内切酶消化竞争性模板的产物成为两个片段，通过电泳等分离检测，根据已知模板的量推测未知模板的起始拷贝数。2023/4/1915第15页，共113页，2023年，2月20日，星期三酶联免疫利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固定在固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素抗体－辣根过氧化物酶结合物，检测酶底物显色情况，通过内标－标准曲线实现定量检测的目的。2023/4/1916第16页，共113页，2023年，2月20日，星期三酶联杂交法捕获探针（检测TNF-α）

3'–TCGGCGTAGCGGCAGAGGATGGTCT-CCCCCC-NH2-5'检测探针（检测TNF-α）

3'-Biotin-TTGGGGCTCACTGTTCGGACATCGGGTA-5'2023/4/1917第17页，共113页，2023年，2月20日，星期三

：NH2标记的探针

：Biotin标记的探针Avidin-HRP显色系统

：NOS基团酶联杂交法2023/4/1918第18页，共113页，2023年，2月20日，星期三定量PCR

——动力学方法

首先，确定PCR扩增的效率（E）然后，根据相应的公式计算原始模板数2023/4/1919第19页，共113页，2023年，2月20日，星期三影响PCR扩增效率（E）的因素整个扩增过程中：E取决于：引物/靶核酸的杂交反应试剂的相对量DNA聚合酶/靶核酸之比例*其他可能影响E的因素（系统之间的差异）样本在扩增仪中的位置不同的临床样本中DNA聚合酶抑制物的去除程度靶核酸链的再退火及酶过量可致Ev降低2023/4/1920第20页，共113页，2023年，2月20日，星期三改良方法：极限稀释分析首先将原始模板进行梯度稀释然后对该稀释系列进行PCR扩增测定最低的阳性样本被认为含有与一已知的标准稀释系列中最后的阳性样本中相同量的PCR模板2023/4/1921第21页，共113页，2023年，2月20日，星期三

极限稀释法示意图2023/4/1922第22页，共113页，2023年，2月20日，星期三

极限稀释法优点：不需要特殊设备方法简单缺点：2023/4/1923第23页，共113页，2023年，2月20日，星期三

极限稀释分析的缺点①必须建立扩增反应条件的标准化：如初始含量、试剂浓度和比例、循环参数等②不同批次的PCR测定的效率有可能不同，因而测定重复性较差③含低拷贝数的样本中存在高斯（Gaussian）（正态）分布。因此，为正确判定最低阳性样本，必须对每一稀释度多次重复测定

严格注意污染，避免假阳性的产生2023/4/1924第24页，共113页，2023年，2月20日，星期三传统PCR定量方法的特点和不足1.定量的准确度：传统PCR定量方法的共同特点是针对PCR扩增的最终产物进行分析。因受酶活性、扩增效率、尤其是平台效应等诸多因素的影响，检测重现性极差，无法直接从终产物量推算出起始模板的精确含量。2023/4/1925第25页，共113页，2023年，2月20日，星期三2.假阳性污染：传统PCR定量方法均依赖于各种不同类型的PCR后处理过程，这些过程极易使数量巨大的PCR扩增产物飞散到实验室的环境中，造成待检样本的污染，导致假阳性结果的上升。传统PCR定量方法的特点和不足2023/4/1926第26页，共113页，2023年，2月20日，星期三实时荧光定量PCR在PCR反应体系中引入DNA结合荧光染料或荧光探针，对每一循环扩增反应产物DNA片段的累积情况进行实时监测记录，通过数学模型实现对起始模板的定量及定性的分析。其特点为全封闭（污染少）、高精确、高灵敏。2023/4/1927第27页，共113页，2023年，2月20日，星期三实时荧光定量与常规PCR的区别常规PCR：

通过电泳、酶联等后处理技术，对PCR扩增反应的终末产物进行定量及定性分析。实时荧光定量PCR：通过引入DNA结合荧光染料或荧光探针，对PCR扩增反应过程中每一轮循环产物的累积进行实时检测，从而实现对起始模板的定量及定性分析。2023/4/1928第28页，共113页，2023年，2月20日，星期三PCRRealtimePCRS1S2M实时荧光定量与常规PCR的区别2023/4/1929第29页，共113页，2023年，2月20日，星期三在实时荧光定量PCR技术中常用的概念荧光共振能量转移（fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET）：在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团（供体）的发射光谱与另一基团（受体）的激发光谱有一定的重叠，当两个基团之间的距离足够近（小于100Å）时，以供体基团的激发波长进行激发，可获得由受体基团发射的荧光。2023/4/1930第30页，共113页，2023年，2月20日，星期三即：在供体基团的激发状态下由一对偶极子介导的能量直接转移给了受体。在此过程中没有光子的参与，是非辐射性的能量转移过程，转移效率与供体－受体两个基团之间距离的6次幂倒数成正比例。2023/4/1931第31页，共113页，2023年，2月20日，星期三FRET产生条件1.存在荧光供体和受体，而且供体的发色光谱与受体的激发光谱有重叠常用的FRET组合：

CFP-YFP/CFP-dsRED/BFP-GFP/GFP-dsRED/YFP-dsRED/Cy3-Cy5/Alexa488-Alexa555/Alexa488-Cy3/FITC-TRITC/YFP-TRITC/YFP-Cy3

2023/4/1932第32页，共113页，2023年，2月20日，星期三

2供体和受体的距离足够近：1-10nm

（1－10nm为分子内/间互作的距离：如蛋白质构象转变、酶催化反应等。）

——超显微观察

3合适偶极方向

4足够荧光寿命 无FRETFRETFRET产生条件2023/4/1933第33页，共113页，2023年，2月20日，星期三荧光域值线（fluorescencethresholdline）：背景荧光与荧光信号的分界值，可以通过标准曲线或经验来设定，常设定为初始3-7个循环荧光值标准差的10倍。在实时荧光定量PCR技术中常用的概念2023/4/1934第34页，共113页，2023年，2月20日，星期三阈值2023/4/1935第35页，共113页，2023年，2月20日，星期三ThresholdlineC(t)valueCt值：是在PCR扩增过程中，各反应管的荧光信号与荧光域值线的交叉点所对应的循环次数（指数扩增的开始阶段）。在实时荧光定量PCR技术中常用的概念2023/4/1936第36页，共113页，2023年，2月20日，星期三CT值荧光信号穿过阈值线时的循环次数2023/4/1937第37页，共113页，2023年，2月20日，星期三

每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数值存在线性关系。起始拷贝数越多，Ct值越小。用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，由此可对样本中目标基因的含量进行精确计算。初始模板浓度的确定2023/4/1938第38页，共113页，2023年，2月20日，星期三DetermineC(t)valueforunknownInterpolatequantityofunknownusingthestandardcurveunknown104103Unknowncontains3108copies2023/4/1939第39页，共113页，2023年，2月20日，星期三用Ct值定量的意义实时荧光定量PCR方法利用循环阈值（Ct）的概念，在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此该Ct值具有极好的重复性。

2023/4/1940第40页，共113页，2023年，2月20日，星期三

相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重复96次扩增的扩增曲线图

终点处检测产物量不恒定；Ct值则极具重现性

2023/4/1941第41页，共113页，2023年，2月20日，星期三绝对定量成为可能灵敏度高：可检测10–100个细胞中１个拷贝数量的基因低拷贝基因的检测细小倍数差异样品的检测实时荧光定量PCR的优势2023/4/1942第42页，共113页，2023年，2月20日，星期三线性范围宽(6-9个数量级)，无需稀释高浓度样品可以在一次实验中同时检测定量高表达和低表达基因荧光探针使PCR产物检测特异性进一步提高全封闭无PCR后处理*几乎没有污染机会实时荧光定量PCR的优势2023/4/1943第43页，共113页，2023年，2月20日，星期三

相对定量和绝对定量：相对定量指的是确定样本中靶序列相对于另一参照样本中靶序列量的变化值，绝对定量指的是确定样本中靶序列的拷贝数。实时荧光定量PCR的定量方法2023/4/1944第44页，共113页，2023年，2月20日，星期三相对定量的方法：标准曲线法比较Ct值法绝对定量的方法：标准曲线法实时荧光定量PCR的定量方法2023/4/1945第45页，共113页，2023年，2月20日，星期三标准曲线法：制作标准曲线的标准序列的绝对量是未知的，将标准品进行相对稀释制成曲线，用以计算样本靶序列的含量，结果为样本靶序列与标准序列的比值。相对定量方法2023/4/1946第46页，共113页，2023年，2月20日，星期三比较Ct法:运用数学公式计算相对量，前提是假设每个循环增加一倍的产物量，在PCR反应的指数期得到Ct值来计算起始模板的量。前提：靶基因和内源控制物的扩增效率基本一致。相对定量方法2023/4/1947第47页，共113页，2023年，2月20日，星期三标准曲线法：制作标准曲线的标准序列的绝对量是已知的，将标准品进行相对稀释制成曲线，用以计算样本靶序列的含量，结果为样本靶序列的绝对含量。质粒DNA和体外转入的RNA常用作绝对定量标准品。标准品的量可根据260nm的吸光度值并用DNA或RNA的分子量来换算成其拷贝数。绝对定量方法2023/4/1948第48页，共113页，2023年，2月20日，星期三DNA结合染色：SYBRGreen1水解探针：TaqManMolecularBeacons荧光标记引物杂交探针实时荧光定量PCR使用的荧光化学方法2023/4/1949第49页，共113页，2023年，2月20日，星期三SYBRGreenISYBRGreen12023/4/1950第50页，共113页，2023年，2月20日，星期三SYBRGreenI工作原理SYBRGreen1

结合到双链DNA的小沟部位SYBRGreen1

染料只有和双链DNA结合后才发荧光。GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAA2023/4/1951第51页，共113页，2023年，2月20日，星期三BoundSYBRGreenIUnboundSYBRGreenIPCRSYBRGreenIfluorescenceincreasesuponbindingdsDNAPost-amplificationmeltingcurveanalysisSYBRGreenI工作原理2023/4/1952第52页，共113页，2023年，2月20日，星期三SYBRGreenI工作原理2023/4/1953第53页，共113页，2023年，2月20日，星期三荧光强度Vs温度荧光强度的变化是由于温度不断升高双链DNA解离，SGI重新游离到溶液中Tm是熔解曲线的特征值TemperatureincreasesFluorescencedecreasesTmSYBRGreenI熔解曲线分析2023/4/1954第54页，共113页，2023年，2月20日，星期三以荧光值随温度变化作负导-dIdTTmSYBRGreenI熔解曲线分析2023/4/1955第55页，共113页，2023年，2月20日，星期三SYBRGreen熔解曲线分析

2023/4/1956第56页，共113页，2023年，2月20日，星期三SYBRGreen法优缺点优点:对DNA模板没有选择性适用于任何DNA使用方便--不必设计复杂探针非常灵敏便宜2023/4/1957第57页，共113页，2023年，2月20日，星期三SYBRGreenI反应体系的设计反应体系的组成：传统PCR反应体系+SYBRGreenI1.SG浓度：终浓度1:5,000－1:100,000，一般为1:10,000—1:70,0002023/4/1958第58页，共113页，2023年，2月20日，星期三

2.Primer浓度：设计原则同普通PCR

终浓度50nM－300nM

固定模板浓度的梯度实验不加模板的对照实验（NTC）

——有无非特异信号SYBRGreenI反应体系的设计2023/4/1959第59页，共113页，2023年，2月20日，星期三

熔解曲线的分析——是否单峰

建议使用HPLC纯化的引物3.MgCl2浓度

降低MgCl2浓度以减少非特异性产物

最低可至1.5nM同时做梯度实验和NTC对照SYBRGreenI反应体系的设计2023/4/1960第60页，共113页，2023年，2月20日，星期三

4.反应温度和时间参数：反应温度参考所用酶的种类；退火温度使用温度梯度功能优化；反应时间与常规PCR类似；扩增片断一般为200－300bp。SYBRGreenI反应体系的设计2023/4/1961第61页，共113页，2023年，2月20日，星期三不同读板温度对实验结果的影响：80℃2023/4/1962第62页，共113页，2023年，2月20日，星期三不同读板温度对实验结果的影响：86℃2023/4/1963第63页，共113页，2023年，2月20日，星期三

SYBRGreenI的特点和不足不涉及特异的探针，方法设计简单，特异性差；荧光强度依赖于体系中所有的dsDNA分子，不能区分引物二聚体、非特异性扩增片断等；通过绘制溶解曲线可较好地保证特异性。

2023/4/1964第64页，共113页，2023年，2月20日，星期三优化的读板温度

-高于非特异产物的Tm值

-低于目标产物的Tm值AmpliconNon-specificproducts熔解曲线分析的应用2023/4/1965第65页，共113页，2023年，2月20日，星期三TaqMan探针荧光素淬灭剂TaqMan水解型杂交探针2023/4/1966第66页，共113页，2023年，2月20日，星期三TaqMan目标特异性探针5’为荧光素，3’为淬灭剂5’荧光素3’淬灭剂与目标序列互补2023/4/1967第67页，共113页，2023年，2月20日，星期三RQReporterQuencherRQIntactprobe-reporterquenchedbyFRETFRRQDuringPCR,probehybridizestotargetsequenceRQProbeispartiallydisplacedduringextensionRQProbecleavedby5’-3’nucleaseactivityofpolymeraseRQFreereporterexhibitsunquenchedfluorescenceTaqMan工作原理2023/4/1968第68页，共113页，2023年，2月20日，星期三Taqman探针反应体系的设计引物、探针设计原则：优先选择探针的序列；Tm值应比引物的Tm值高8－10度（68－70）；GC含量：30－80％；长度不应超过30碱基，18-30bp,optimal20；5’端不应是G，G有可能会淬灭荧光素。

2023/4/1969第69页，共113页，2023年，2月20日，星期三Taqman探针反应体系的设计选择合适的模板链，使探针的Cs>Gs；扩增片断不超过400bp，通常为80－150bp。避免相同碱基连续出现，特别是四个或四个以上Gs连续出现；引物应尽量靠近探针；引物的Tm值为59－60度，长度约20碱基；避免引物、探针之间的二级结构。2023/4/1970第70页，共113页，2023年，2月20日，星期三引物、探针浓度的优化

目标：最高的信号/背景比，最小的Ct值

引物浓度：50nM－900nM

探针浓度：50nM－250nM

通过多次实验确定各自的浓度和比例Taqman探针反应体系的设计2023/4/1971第71页，共113页，2023年，2月20日，星期三Taqman探针的不足采用荧光淬灭及双末端标记，淬灭难以彻底，本底较高；采用酶外切活性，受酶性能影响；探针标记成本较高。改进：用不发光的淬灭荧光分子取代TAMRA2023/4/1972第72页，共113页，2023年，2月20日，星期三Molecular

BeaconsMolecularBeacons发夹型杂交探针2023/4/1973第73页，共113页，2023年，2月20日，星期三MolecularBeacons茎由互补配对的序列组成环与目标序列完全配对茎荧光素淬灭剂环2023/4/1974第74页，共113页，2023年，2月20日，星期三Target-loopinteractionmorestablethanstem-stemTACCGGGGGTTACGAACGGTAATTTTTGCCCCCAAAAQRTargetDuringtheannealingstep:ProbebindstargetReporterandquencherseparatedTarget-specificfluorescenceMolecularBeacons

2023/4/1975第75页，共113页，2023年，2月20日，星期三MolecularBeacons特点和不足对目标序列有很高的特异性；是用于SNP检测的最灵敏的试剂之一；采用非荧光染料作为淬灭分子，荧光本底低；不能完全与模板结合，稳定性差；探针合成标记较复杂。2023/4/1976第76页，共113页，2023年，2月20日，星期三引物/探针设计和评估相关的免费网站

1．引物/探针的设计

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Primer3(WhiteheadInstitute,MIT)

/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi

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GeneFisher(BielefeldUniversity)

http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/cgi-bin/gf_submit?mode=STARTUP&qid=na&sample=dna

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2023/4/1977第77页，共113页，2023年，2月20日，星期三

1．引物/探针的设计

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FastPCR(Biocenter,UniversityofHelsinki)

http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/bare-1_html/oligos.htm

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PerlPrimer(OwenMarshall)

/

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PrimerDesignAssistant(DivisionofBiostatisticsandBioinformatics,NationalHealthResearchInstitutes)

.tw/primer/

引物/探针设计和评估相关的免费网站2023/4/1978第78页，共113页，2023年，2月20日，星期三．2.反转录(RT)PCR引物设计

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ExonPrimer(TechnischeUniversität,München)

http://ihg.gsf.de/ihg/ExonPrimer.html

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AutoPrimer(DeutschesKrebsforschungszentrum)

http://www.autoprime.de/

3.引物特异性的验证

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Blast(NCBI) /BLAST/引物/探针设计和评估相关的免费网站2023/4/1979第79页，共113页，2023年，2月20日，星期三

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GeneWalker(Cybergene)

http://www.cybergene.se/primerdesign/genewalker/genewalker11.html

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OligonucleotideAnalyzer(RNAture)

/oligonucleotide.html

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OligonucleotidePropertiesCalculator(NorthwesternUniversity)

/biotools/oligocalc.html

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mfold(MichaelZuker,RensselaerPolytechnicInstitute)

/applications/mfold/old/dna/引物/探针设计和评估相关的免费网站2023/4/1980第80页，共113页，2023年，2月20日，星期三5．扩增子二级结构的评估

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mfold(MichaelZuker,RensselaerPolytechnicInstitute)

/applications/mfold/old/dna/

引物/探针设计和评估相关的免费网站2023/4/1981第81页，共113页，2023年，2月20日，星期三实时荧光定量PCR技术的应用

病原体检测；肿瘤研究；基因表达研究；免疫组份分析；基因突变及多态性的研究2023/4/1982第82页，共113页，2023年，2月20日，星期三实时荧光定量PCR技术的应用

病原体检测：检测患者血清中肝炎病毒浓度为临床药物治疗和疗效观察提供依据；检测HIV的量预测发病时间；选择治疗药物：干扰素对肝炎病毒高拷贝者不敏感，对低拷贝者敏感。2023/4/1983第83页，共113页，2023年，2月20日，星期三实时荧光定量PCR技术的应用

肿瘤研究：癌基因及其相关基因的定量检测可进行肿瘤的早期诊断、分型、分期和预后判断；检测治疗中和治疗后微量残余恶性细胞存在的数量，作为治疗效果和估计复发危险性的依据。2023/4/1984第84页，共113页，2023年，2月20日，星期三基因差异表达研究标准曲线法

使用标准曲线来确定基因表达上的差异相对定量法(2－△△Ct法)

不使用标准曲线，直接分析得到基因差异表达的倍数关系2023/4/1985第85页，共113页，2023年，2月20日，星期三标准曲线法步骤：1.通过标准曲线分别测出目标基因和内标基因的量2.均一化校正（Normalization)3.比较不同样品间目标基因表达差异2023/4/1986第86页，共113页，2023年，2月20日，星期三相对定量法前提目标基因和看家基因的扩增效率一致，且接近100％。步骤通过实时荧光曲线得到目标基因和看家基因的Ct值均一化校准△Ct=Ct目标基因－Ct看家基因△△Ctn=△Ctn－△Ct0（不同时间、不同组织)基因差异表达的倍数＝2－△△Ct2023/4/1987第87页，共113页，2023年，2月20日，星期三基因突变及多态性-SNP检测2023/4/1988第88页，共113页，2023年，2月20日，星期三基因分型方法

使用TaqMan探针

(双色法)溶解曲线

(单色法)序列特异PCR

(单色法)2023/4/1989第89页，共113页，2023年，2月20日，星期三FRFQGVQTCSNPG/AFQGVQTForwardprimerReverseprimerAllele-specificprobeAllele-specificprobe用TaqMan探针进行基因型分析SNP检测-基因型分析2023/4/1990第90页，共113页，2023年，2月20日，星期三QF5’GCQ5’3’CGFQV5’3’CTQ5’3’HybridizationofTaqManProbeDigestionofprobe-fluorescenceNOdigestionofprobe-NOfluorescenceTVQGFQMatchforAllele1ReducedEfficiencyofProbeHybridizationMismatchforAllele1Polymerase多色双通道技术应用-基因型分析2023/4/1991第91页，共113页，2023年，2月20日，星期三从病人血液样品中提取DNA基因型分类：A/A(Allele1)G/G(Allele2)G/A(Heterozygote)CFQTVQ多色双通道技术应用-基因型分析2023/4/1992第92页，共113页，2023年，2月20日，星期三Allele1controlVICFAM多色双通道技术应用-基因型分析2023/4/1993第93页，共113页，2023年，2月20日，星期三Allele2controlVICFAM多色双通道技术应用-基因型分析2023/4/1994第94页，共113页，2023年，2月20日，星期三HeterozygotecontrolFAMVIC多色双通道技术应用-基因型分析2023/4/1995第95页，共113页，2023年，2月20日，星期三VICFAM2023/4/1996第96页，共113页，2023年，2月20日，星期三多色双通道技术应用-基因型分析2023/4/1997第97页，共113页，2023年，2月20日，星期三SYBRGreenI进行SNP分析T5’PCRprimerswithSNPsiteat3’endC5’

末端不匹配会导致PCR效率上有大约1000倍的差异，由此导致产物积累会有10个cycles延迟

末端匹配与否，与反应终产物量的多少没有必然联系

PCR#1PCR#22023/4/1998第98页，共113页，2023年，2月20日，星期三SYBRGreenI进行SNP分析MatchMismatch2023/4/1999第99页，共113页，2023年，2月20日，星期三SYBRGreenI进行基因分型Amplicon1Amplicon2GCHigherTm…distinctthermalprofileLowerTm…distinctthermalprofile2023/4/19100第100页，共113页，2023年，2月20日，星期三SYBRGreenI进行基因分型Intensity-dI/dT2023/4/19101第101页，共113页，2023年，2月20日，星期三TaqMan®MicroRNA分析方法

加长靶基因的反转录荧光定量PCR2023/4/19102第102页，共113页，2023年，2月20日，星期三miRNAs的研究

MicroRNAs是一种内源性长度在２２个碱基左右的RNA分子，它在动植物中具有重要的基因调控作用，它们通过与mRNAs结合抑制翻译或造成mRNAs被酶解切割而起作用目前在各种生命体中发现的miRNAs类型共有约700种以上,通过实验验证或经数据库和软件推