分离纯化的前期步骤课件

第八章生化物质的制备和分离纯化

生化物质的制备和分离纯化分离纯化的一般步骤选材细胞破碎抽提分离纯化结晶纯度鉴定保存8.1分离纯化的一般步骤选材细胞破碎抽提分离（沉淀法、离子交换法）纯化（分子筛、电泳）结晶纯度鉴定保存第一步是前处理(pretreatment)。分离提纯某一蛋白质，首先要求把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。第二步是粗分级(roughfractionation)。当蛋白质混合物提取液获得后，选用一套适当方法，将所要的蛋白质与其他杂蛋白质分离开来。一般这一步的分级用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。第三步是细分级(finefractionation)，也就是样品的进一步提纯。样品经粗分级以后，一般体积较小，杂蛋白大部分已被除去。进一步提纯，一般使用层析法包括凝胶过滤，离子交换层析，吸附层析以及亲和层析等。必要时还可选择电泳法。8.2材料的选择与处理含量高容易得到干扰物质少价格便宜容易分离安全性好清理除杂冷冻干燥浓缩微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况:（1）得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；（2）利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。（1）碾磨法/组织捣碎法是最普通和常见的细胞破碎方法。既可以使用普通的高速组织捣碎机、细胞匀浆器，也可使用专门的用于微生物细胞破碎的细菌磨等。

(2)超声波破碎法使用专一的超声波破碎仪，利用仪器所产生的超声波（10~15kHz）机械震动后对组织细胞产生的空化作用（Cavitation）使细胞破碎。对动物材料的效果比微生物材料和植物材料要好。

(3)渗透压法（高渗或低渗处理）渗透压就是用来抗衡渗透倾向所需的一种力。

先将细胞置于高渗溶液(如蔗糖溶液)中平衡一段时间后，突然将其转入到低渗缓冲液和水溶液中，则细胞壁会因渗透压的突然变化而破碎。此法只适于处理细胞壁比较脆弱的细胞。

(5)表面活性剂处理法：在适当的温度、pH及低离子强度下，表面活性剂（如SDS、Tween、TritonX）能与脂蛋白形成微泡，使膜的渗透性改变或使之溶解。此法对膜结合的酶的提取是相当有效的，但对其他蛋白质则易使之变性，甚至切断肽链。

（6）细胞自溶法利用细胞自身的酶(8)酶处理方法用外源的溶菌酶或细胞壁分解酶(如蛋白酶、脂肪酶、核酸酶等)在一定条件下作用于细胞而使细胞壁破碎。但这种方法因需外加酶制剂，因此可能会对后续目的酶的提取产生不利的影响。8.4抽提物质的抽提常常和细胞破碎步骤协同进行根据被提取物质的溶解特性，选择适当的溶剂始终保持低温操作，防止生物活性物质变性提取的原则是“少量多次”尽量去除干扰物质防止水解酶的作用加入一定的保护试剂其他影响因素：pH、溶剂极性与离子强度等蛋白质（包括酶）的提取大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。

下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。提取缓冲溶液的选择必须有合适的pH和离子强度添加一些稳定剂。如巯基乙醇、DTT、甘油、蔗糖、乙二醇等添加金属离子或络合剂。如Mg++、EDTA等添加蛋白酶抑制剂。如DPF（磷酸二异丙基氟）（二）有机溶剂提取法一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。8.5初级分离技术主要是根据不同物质在各种物理化学性质上的差别和对所分离纯化物质的要求而采取相应的分离纯化方法根据溶解度不同的分离方法等电点沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法、PEG沉淀法根据分子大小不同的分离方法透析/超过滤、分子筛、离心法根据分子带电性不同的分离方法离子交换层析、电泳法根据分子吸附性不同的分离方法吸附层析、亲和层析沉淀技术透析/浓缩技术离心技术层析技术电泳技术8.5.1沉淀分离方法（PRICIPITATION）Dextran(右旋糖苷)polyvinylpyrrolidine(乙烯聚合物)acetone(丙酮)polyethyleneimine(聚乙烯亚氨)protamine(鱼精蛋白)streptomycin(链霉素)等电点沉淀法盐析法有机溶剂沉淀法PEG沉淀法其他（1）等电点沉淀法

（Isoelectricpointprecipitation）

粗分离技术沉淀后的蛋白质不变性沉淀可能不完全加酸/碱时一定要搅拌缓慢，防止局部过酸/碱可用于去处杂蛋白或核酸等电沉淀法经常与盐析法或有机溶剂沉淀法联合使用。单独使用等电点法主要是用于去除等电点相距较大的杂蛋白。（2）盐析法盐溶盐析原理：lgS=-Ks*II=∑CZ2/2：主要取决于蛋白质的性质和溶液的温度与pHKs：主要取决于盐的性质。Ks越大，盐析效果越好影响因素蛋白质本身的因素：即不同的蛋白质其发生盐析的条件也不同如血浆蛋白质的盐析（Ks分段盐析）蛋白质盐析时硫酸铵的饱和度纤维蛋白原20%优球蛋白33%拟球蛋白40%清蛋白62%影响因素中性盐的种类与离子强度lgS=-Ks*I；I=1/2∑CZ2硫酸铵氯化钠硫酸铵浓度（饱和度）的计算与调整蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的硫酸铵.它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为4.1M，即767克/升；0度时饱和溶解度为3.9M，即676克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。影响因素温度:除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。影响因素PH:大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。在一定的PH和温度条件下，改变离子强度的盐析叫Ks分段盐析在一定的盐和离子强度条件下，改变PH和温度的盐析叫分段盐析影响因素蛋白质的浓度小比大好，但一般以2.5~3%为宜。蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。实际操作时的注意事项硫酸铵的纯度要高通过小试或资料确定硫酸铵的饱和度确定硫酸铵的添加方式和添加量加盐的速度要适中在硫酸铵饱和度较高时才发生盐析的蛋白质沉淀需离心盐析常常和等电点沉淀协同进行盐析可以在常温下进行盐析沉淀的蛋白质含有较高的盐蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去。常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。（3）有机溶剂沉淀法（冷乙醇、冷丙酮）原理：破坏蛋白质的水化层并降低溶液的介电常数低温操作添加0.05mol/L的中性盐可以减少有机溶剂引起的蛋白质变性，并可以提高蛋白质的分离效果在酶的分离纯化中，使用该方法时，应注意以下几点。（1）由于有机溶剂易使酶发生变性，因此使用该方法时应该在低温下进行。酶沉淀分离后，也应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂浓度，避免变性。（2）有机溶剂沉淀法析出的酶沉淀一般比盐析法析出的沉淀容易过滤或离心分离，分辨力比盐析法好，溶剂也容易除去，但有机溶剂沉淀法易使酶变性，所以操作必须在低温条件下进行。（3）添加0.05mol/L的中性盐可以减少有机溶剂引起的酶变性，并可以提高酶的分离效果。但由于中性盐会增加酶在有机溶剂中的溶解度，故中性盐不宜添加太多。（4）有机溶剂沉淀法一般与等电点沉淀法联合使用。即操作时溶液的pH值应控制在欲分离酶的等电点附近。（4）PEG沉淀法PEG：聚乙二醇（polyethyleneglycol），是一种具有螺旋状和强亲水性的大分子物质，在生化分离中常用的是PEG2000-6000基本原理：利用空间排阻效应lgS+f=x–ac影响因素蛋白质的大小：蛋白质的分子量越大其被沉淀下来所需要的PEG浓度越低蛋白质的浓度：浓度高，易于沉淀，但分离效果差，因此以小于10mg/ml为好PEG的聚合度：PEG的聚合度越高，沉淀蛋白质时所需要的浓度越低，但分离效果差，一般用常用的是PEG2000-6000其他影响因素温度：PEG对酶（蛋白质）有保护作用，因此可以在常温操作，且一次可处理大量样品PH：越接近PI，越易沉淀，一般在PH5-8的范围内影响不大离子强度：离子强度在小于2时影响不大（5）其他沉淀技术重金属盐沉淀（Hg++，Cu++，Zn++，Fe+++，etal）生物碱试剂沉淀（单宁酸、苦味酸、钼酸、三氯乙酸等）8.5.2离心技术（Centrifugation）

离心机的种类与用途离心分离方法的选择离心条件的确定注意事项离心原理

将样品放入离心机转头的离心管内，离心机驱动时，样品液就随离心管做匀速圆周运动，于是就产生了一个向外的离心力。由于不同颗粒的质量、密度、大小及形状等彼此各不相同，在同一固定大小的离心场中沉降速度也就不相同，由此便可以得到相互间的分离。离心力和相对离心力

溶液中的固相颗粒做圆周运动时产生一个向外离心力，其定义为：

F=mω2r

式中：

F为离心力的强度；m为沉降颗粒的有效质量；

ω为离心转子转动的角速度，其单位为r/min；

r为离心半径(cm)，即转子中心轴到沉降颗粒之间的距离。

很显然，离心力随着转速和颗粒质量的提高而加大，而随着离心半径的减小而降低。目前离心力通常以相对离心力Fcf表示，即离心力F的大小相对于地球引力(G)的多少倍，单位为g，其计算公式如下：

Fcf=1.119×10-5ω2r×g

可以看出，在同一转速下，由于f的不同，Fcf相差会很大，实际应用时一般取平均值。在离心实验的报告中，Fcf、r平均、离心时间t和液相介质等条件都应表示出来，因为它们都与样品的沉降速度有直接的联系。显然Fcf是一个只与离心机相关的参数，而与样品并无直接的关系。

沉降速度与沉降系数

一个颗粒要沉降，它必须置换出位于它下方等体积的溶液，这只有当颗粒的质量大于被置换出的液体的质量时才能通过离心的手段达到，否则，在离心过程中颗粒将发生向上漂浮，而不是下沉。当颗粒在运动时，不论方向如何，它都要穿过溶剂分子，所产生的摩擦力总是与颗粒运动的方向相反。摩擦力的大小与颗粒的运动速度成正比，并且受颗粒的大小、形状及介质性质的影响：

式中：

f为颗粒在济剂中的摩擦系数．与颗粒的大小、形状及介质性质相关；

v为颗粒的沉降速度。由于离心力的存在，颗粒将加速运动直到摩擦力与离心力相等。在这种情况下，颗粒所受到的净作用力为零，颗粒将以最大速度运动。

式中Mp和Ms分别为颗粒的质量及等体积的溶剂的质量。

上式中的Mp和Ms很难确定，为了建立分子大小与沉降系数之间的关系，引入了沉降系数这一新的概念。沉降系数定义为沉降速度与离心力的比率或单位离心场中颗粒的沉降速度，它以svedberg单位计算，1S＝1×10-13s。例如，核糖核酸酶A的沉降系数为1．85×10-13s，即可记作1．85S。在生物化学、分子生物学及生物工程等书刊文献中，对于某些大分子化合物，当它们的详细结构和分子量不很清楚时，常常用沉降系数这个概念去描述它们的大小。如核糖体RNA(rRNA)有30s亚基和50s亚基，这里的s就是沉降系数，现在更多地用于生物大分子的分类，特别是核酸。离心机的种类与用途普通离心机最大转速:＜8000rpm；相对离心力RCF：＜1*104g高速离心机最大转速:＜2.5*104rpm；相对离心力RCF：＜1*105g冷冻装置、制动系统等超速离心机最大转速:2.5*104rpm~1*105rpm；相对离心力RCF：1~5*105g冷冻装置、离心管帽、真空系统、制动系统等制备型离心机、分析型离心机离心分离方法的选择常规离心法差速离心技术密度梯度离心法：蔗糖密度梯度离心氯化铯密度梯度离心测定蛋白质等的纯度和分子量M=RTS/D（1-）S：沉降系数：单位离心力下粒子的沉降速率离心条件的确定离心力、离心速度、相对离心力离心时间温度与PH

注意事项正确选择离心条件注意平衡正确取样8.5.3透析（Dialysis）

/超过滤（Ultra-filtration）

透析（Dialysis）与超过滤（Ultrafiltration）技术是利用具有特定大小均匀孔径的透析膜或超滤膜的筛分机理，在不加压（透析）或加压（超过滤）的条件下，把酶提取液通过一层只允许水和小分子物质选择性透过的透析膜或超滤膜，而酶等大分子的物质则被截流，从而达到把小分子物质从酶提取液中除去（透析与超过滤）或同时达到浓缩酶液的目的（超过滤）。这也是透析与超过滤技术的最大区别之一。另外超过滤技术需要具有加压系统的超滤仪，而透析技术则不需要专一的仪器。透析袋酶溶液蒸馏水加压酶溶液超滤膜支持栅板超滤液透析装置超滤装置半透膜的材料：玻璃纸、再生纤维素、聚酰胺、聚砜等半透膜的物理特性：截留分子量Diaflo超滤膜截留分子量XM-300300000XM-100100000PM-2020000不同型号的半透膜其物理特性特别是截留分子量不同，因此在使用前应该根据实际的实验要求做出恰当的选择。透析袋在制造时常会混入许多化学药品，所以使用前最好在EDTA-NaHCO3，溶液中煮过，然后就泡在该溶液内备用。超滤法超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择