生物工程下游技术第三章微载体培养技术课件

第三章微载体培养技术

（microcarrierculturetechnique）

一、何谓微载体？指直径60-250μm，能适用于贴壁细胞生长的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。最初采用在培养液中加人一定数量的小滚瓶，增加细胞生长的贴壁面积。此方法构造简单，成本低，重复性好，放大过程可依靠滚瓶数量的增加。但产率低，劳动强度大，占空间大。如何增加细胞生长的贴壁面积？微载体系统1967年被用于动物细胞大规模培养。兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，放大容易。现广泛用于培养各类细胞，生产疫苗、蛋白质产品。微载体培养系统培养4h，微载体间的细胞“桥联”×200

电镜下串在一起的肝细胞微载体×730由于肝细胞的粘附作用微载体形成“串珠”×400

脊髓灰质炎、狂犬和乙脑等疫苗显微镜下的高密度微载体优良的微载体应具有的特性价廉，能重复使用。不含能毒害细胞的成分；微载体须与细胞有良好的相容性；密度应略大于培养基；粒径在40～120μm范围，生理盐水溶胀后增大到60~250μm，粒度分布地均匀，径差不大于20~25μm；良好的光学透明性；能在PBS中耐120~125℃、20~30min高温灭菌；应是非刚性材料；不吸收培养基中的营养成分；收获细胞或细胞制品容易，不影响蛋白质分离纯化；三、微载体培养原理与操作

1、原理：将对细胞无害的颗粒——微载体加入到培养容器的培养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。丝网微载体通气的培养基鼓泡器搅拌叶轮微载体培养装置图细胞能否黏附，主要取决于细胞与微载体的接触概率和相融性。细胞增殖阶段：黏附贴壁、生长和扩展成单层贴壁依赖性细胞在微载体表面上：贴附是进一步铺展和生长的关键，主要是靠静电引力和范德华力Vero细胞在Cytodex-3微载体表面粘附铺展的形貌变化通常做法：贴壁期采用低搅拌转速，时搅时停；数小时后，待细胞附着于微载体表面时，维持设定的低转速，进入培养阶段。微载体培养的搅拌非常慢，最大速度75r/min。2、搅拌转速：动物细胞无细胞壁，对剪切力敏感，无法靠提高搅拌转速来增加接触概率。3、细胞与微载体的相融性：与微载体表面理化性质有关。一般细胞在进入生理pH值时，表面带负电荷。若微载体带正电荷，则利用静电引力可加快细胞贴壁速度。若微载体带负电荷，因静电斥力使细胞难于黏附贴壁，但培养液中溶有或微载体表面吸附着二价阳离子作为媒介时，则带负电荷的细胞也能贴附。(a)MCC细胞，未经处理的Cytodex-3表面；(b)MCC细胞，用纤粘连蛋白处理后的Cytodex-3表面(c)Vero细胞，未经处理的Cytodex-3表面；(d)Vero细胞，用层粘连蛋白处理的Cytodex-3表面(e)Vero细胞，用纤粘连蛋白处理的Cytodex-3表面细胞（Vero和MCC）在不同外源基质处理的（Cytodex-3）微载体上贴附4、细胞在微载体表面的生长受影响因素：细胞方面：细胞群体、状态和类型。微载体方面：微载体表面状态、吸附的大分子和离子；微载体表面光滑时细胞扩展快，表面多孔则扩展慢。培养环境中：培养基组成、温度、pH、DO以及代谢废物等均明显影响细胞在微载体上的生长。如果所处条件最优，则细胞生长快；反之生长速度慢。

交联葡聚糖纤维素为基质微载体蛋白质为基质微载体（变性胶原微载体:蛋黄色，表面特性好，易与细胞结合）高分子材料为基质微载体无机玻璃基质微载体

微载体基质PCL微球表面多皱，PLLA微球表面布满坑洞，PGLA微球表面光滑不同种类聚酯的微球表面形貌差异多孔载体培养优点:降低血清用量，增加细胞固定性。生长空间大，免受机械损伤，可以提高搅拌强度和通气量，强化传质。多孔载体不仅能培养贴壁细胞，也适合悬浮细胞的固定化连续灌流培养。多孔载体固定细胞过程简单，对细胞无毒害和损伤，细胞可从长满细胞的微载体中自动转移到未长细胞的新载体上生长，接种方便，培养简单，特别适合于反应器大规模培养。5、微载体培养操作要点

●培养初期：

保证培养基与微球体处于稳定的pH与温度水平，接种细胞（对数生长期）至终体积1/3的培养液中，以增加细胞与微载体接触的机会。不同的微载体所用浓度及接种细胞密度不同，常使用2-3g/L的微载体含量，更高的微载体浓度需要控制环境或经常换液。

贴壁阶段（3-8d）后，缓慢加入培养液至工作体积，并且增加搅拌速度保证完全均质混合。●培养维持期：进行细胞计数（胞核计数）、葡萄糖测定及细胞形态镜检。随着细胞增殖，微球变得越来越重，需增加搅拌速率。经过3d左右，培养液开始呈酸性，需换液（停止搅拌，让微珠沉淀5min，弃掉适宜体积的培养液，缓慢加入新鲜培养液（37℃），重新开始搅拌。●微载体培养的放大：可以通过增加微载体的含量或培养体积进行放大。使用异倍体或原代细胞培养生产疫苗、干扰素，已被放大至4000L以上。细胞形态饱满、生长良好细胞形态更加立体，轮廓清晰，细胞数量明显增加，少量微载体上细胞几乎长满微载体上细胞基本长满，细胞形态健康微载体上细胞更加致密，细胞密度达到5×106个/ml以上微载体上细胞依然良好，没有明显细胞脱落现象

Marc145细胞微载体培养第1天

Marc145细胞微载体培养第2天

Marc145细胞微载体培养第3天

Marc145细胞微载体培养第4天

Marc145细胞微载体培养第