基因工程的载体课件

第三章基因工程的载体前言载体通论第一节质粒载体第二节

λ噬菌体载体第三节单链丝状噬菌体载体本课件是在网络资源基础上改进而成，在此对有关人士特致感谢！前言载体通论一、基本概念

利用重组DNA技术分离目的基因，称之为基因克隆(genecloning)。克隆(clone)：作物动词时是指从单一祖先产生同一的DNA分子群体或细胞群体的过程，作名词时指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊群体。基因文库(genelibrary)：由大量的含有基因组DNA的不同DNA片段的克隆所构成的群体。载体(vector)：在基因工程中，携带着目的基因或DNA片段进入宿主细胞进行扩增或表达的工具DNA分子。二、分类

克隆载体表达载体质粒载体噬菌体载体人工染色体按载体功能分按载体性质分三、基因工程载体必须具备的条件：

※（1）有复制起点

※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点

※（3）具备合适的筛选标记

※（4）具备合适的拷贝数目（5）分子量要相对较小（6）在细胞内稳定性要高（7）易分离纯化※表示载体必须具备的条件第一节质粒载体一、质粒(plasmid)的基本特性

Plasmid独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。质粒是细菌染色体外能自主复制的环形双链DNA分子。质粒DNA多呈超螺旋的共价闭合环状DNA(covalentlyclosedcircular,cccDNA)，大小为1-200kb，可以持续稳定地处于游离状态，但一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随染色体复制而复制。编码抗菌素抗性基因的质粒叫R质粒。质粒DNA在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒，并在真核细胞中表达，因此应用广泛。1、质粒的复制：由复制子(ori，复制起始区及与此相关的顺式作用元件)决定。质粒复制的机理请见教材。2、质粒的拷贝数：根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为严紧型复制质粒（拷贝数少，为1-5个）与松弛型复制质粒（拷贝数多，可达10-200个拷贝）。作为载体的质粒一般应该是松弛型的。拷贝数是由复制起始点的类型决定的，如pMB1或ColE1。

pUC系列载体中的突变型pMB1复制子可达500-700个拷贝。3、质粒的不亲和性(incompatibility)：两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。涉及细胞分裂过程中的竞争性选择。不相容群。4、质粒的转移性：自然条件下质粒可通过细菌的接合(conjugation)的作用而转移到新的宿主细胞中。三亲杂交法。质粒载体应具备的条件：1有特定的复制起始子。2有多种限制性内切酶切点，但每种切口最好只有1个；3有选择标记，例如抗药性标记，蓝白斑试验；4有一定容量；5有相当的拷贝数，即每个宿主菌可能容纳的最多数。2023/4/18西南大学生物技术专业基因工程102、筛选标记基因：用于将重组子与非重子区别开来。α-互补(αcomplementation)：人工突变使大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因(lacZ)缺失N-端的第11-41位氨基酸，而载体则携带有LacZ基因的N-端140个氨基酸和编码区段(lacZ’)，二者单独存在时均无功能，但共存于一个大肠杆菌细胞时则发生功能互补，形成具有完全活性的LacZ酶。多克隆位点(multiplecloningsite)：载体上的一段人工设计和人工合成的DNA序列，含有多个在该载体唯一的限制性内切酶的切点，以方便载体与外源片段的重组。插入失活(insretionalinactivation)：当一段足够长的外源DNA片段插入到一个功能基因的编码区后，导致ORF移码或提前终止，严重破坏原基因的编码能力而使该基因失活。蓝白斑筛选(white-bluescreening)：空载体转化子经IPTG诱导表达后，由于α-互补而形成的功能性的LacZ蛋白，能够转化无色底物X-gal而形成深蓝色的产物，使菌落或噬菌斑显蓝色(蓝斑)；重组载体的转化子中，由于lacZ’基因的插入失活而不能形成α-互补，在IPTG+X-gal条件下菌落或噬菌斑不显蓝色(白斑)；通过菌落或噬菌斑的蓝/白色差异而达到筛选鉴定出重组子与非重组子的目的。三、质粒载体的种类质粒的发展阶段

第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101、ColE1、pCR、pBR313和pBR322。

第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。

第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3、T7、SP6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。普通型载体pBR322的结构图插入失活法以pBR322为基础的重组子筛选方法2）pUC18/pUC19质粒系列

pUC质粒系列是在pBR322基础上改建成的。它含有pBR322的大部分，包括完整的Ampr基因和复制起始点。去除了pBR322的tetr区段，换用了M13噬菌体的476bp片段，含LacZ基因及其启动子的操纵基因、M13的多聚接头polylinker。

pUC18与pUC19只是多克隆位点的排列方向相反，其余一致。476bp片段含有E.coli的LacZ基因的5’序列，表达半乳糖苷酶的α片段。

LacZ的上游包括乳糖操纵子上的启动子Plac和操纵基因O。

LacZ之内是M13的克隆位点。2023/4/18西南大学生物技术专业基因工程213）pUC118/pUC119质粒系列在pUC18/pUC19质粒基础上，增加了带有M13噬菌体DNA合成的起始和终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列，也称为噬菌粒。4）pGEM-3Z/4Z质粒系列在pUC18/pUC19质粒基础上，在多克隆位点两端添加了噬菌体的转录启动子，可用于体外转录和翻译。5）多功能质粒载体典型的为pBluescriptⅡKS(±)、pBluescriptⅡSK(±)，具有多克隆位点、α-互补、噬菌体启动子、单链噬体的复制与包装信号等。K=KpnⅠ，S=SacⅠ2023/4/18西南大学生物技术专业基因工程222、表达载体一般是在克隆的载体上添加和完善了用于外源基因表达的一些基本元件，如强启动子、蛋白纯化标签、信号肽、诱导表达元件等。如Novagen的pET系列、Qiagen的pQE系列。以后有详讲解。第二节

λ噬菌体载体一、λ噬菌体的分子生物学λ噬菌体的组成结构和用途噬菌体是比细菌还小得多的微生物，和病毒侵犯真核细胞一样，噬菌体侵犯细菌，也可以认为它是细菌里的“寄生虫”。它本身是一种核蛋白，核心是一段DNA，结构上有一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把噬菌体的DNA注入细菌内。λ噬菌体基因大致分为4个区：结构区：A～J19个基因，编码头、尾部蛋白质为结构区。组区att(attachment)、int(intagrate)及xis(excission)。调控区启动子、终止子和N、CI基因。裂解区：Q-R。2023/4/18西南大学生物技术专业基因工程26λ噬菌体可以容纳较大的目的基因。例如用置换法可去掉长达20kb的λDNA，换入相应长度的目的基因。基因文库构建常使用λ载体。不少先进的质粒应用λ组件进行构建。二、λ载体的选择标记1、基因组大小：原基因组的75-105%大小时可以包装，否则不能包装。2、LacZ基因：象质粒一样进行蓝白斑筛选。3、cⅠ基因失活：该基因表达时促进进入溶原状态，该基因失活后促进进入裂解状态。2023/4/18西南大学生物技术专业基因工程29第三节单链丝状噬菌体载体一、M13噬菌体载体

M13噬菌体属丝状噬菌体，其基因组为闭合环状正链ssDNA，6407bp，其中90%的DNA都编码蛋白质，有10个基因，有两个较长的间隔区，是外源基因插入的部位。M13噬菌体产生单双链DNA的机制。1、以(+)链DNA为摸板，合成互补(－)链，该双链称复制型DNA（RFDNA）。2、RFDNA在宿主细胞内能快速增殖，达每个细胞约200个拷贝。3、单链特异的DNA结合蛋白结合在(+)链上，从而阻断了其互补链，即(－)链的合成，这样，细胞就会不断的合成(+)链DNA。2023/4/18西南大学生物技术专业基因工程30++-+-+-+-+-+-单链结合蛋白RF型DNA复制约200拷贝+++++以-链DNA为模板合成+链DNA2023/4/18西南大学生物技术专业基因工程314、游离出来的(+)链DNA先与基因V的编码产物形成特异的DNA-蛋白质复合物，然后转移到寄主细胞膜，同时基因V的蛋白质从(+)DNA链上脱落下来，余下的M13(+)链DNA则是从其感染的寄主细胞的细胞膜溢出的过程中，被外壳蛋白包装成病毒颗粒的。二和三：略四、丝状噬菌体载体的用途和问题用途：制备单链DNA，用作探针、测序等。问题：外源DNA的部分缺失、外源DNA的单方向插入等。2023/4/18西南大学生物技术专业基因工程32五、噬菌粒噬菌粒实际上是带有噬菌体大间隔区的质粒载体，是集质粒和丝状噬菌体的有利特征于一身的载体，具有ColE1复制起点及抗生素