用血红蛋白的提取与分离

用血红蛋白的提取与分离第1页/共32页(一)蛋白质分离和提取的原理一.基础知识根据蛋白质各种特性的差异：分子的形状、大小电荷性质和多少溶解度吸附性质对其他分子亲和力

第2页/共32页高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？变性、变性、空间结构人们用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白第3页/共32页（二）蛋白质提取和分离的方法凝胶色谱法：又称分配色谱法电泳法第4页/共32页1.凝胶色谱法2）材料：凝胶(分配色谱法)1）概念

根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法凝胶是微小的多孔性球体，如葡聚糖或琼脂糖。内部有许多贯穿的通道。第5页/共32页第6页/共32页3.凝胶色谱法的原理—分子筛效应大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。第7页/共32页凝胶色谱柱洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。第8页/共32页2.电泳1)概念带电粒子在电场作用下发生迁移的过程2)原理利用了待分离样品中各分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。第9页/共32页3)类型:琼脂糖凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳4)实例：SDS——聚丙稀酰胺凝胶电泳用途:测定蛋白质的分子量鉴定蛋白质的纯度原理：SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。使电泳迁移速率完全取决于分子的大小。第10页/共32页讨论：如何测定蛋白质的分子量？使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。

第11页/共32页血液血浆水分其他物质：血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（90％）两个α－肽链两个β一肽链四个亚铁红素基团

血液有哪些成分？

第12页/共32页(三)缓冲溶液抵制外界的酸或碱对溶液pH值的影响，维持pH基本不变1.作用2.配制如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4

说出人体血液中缓冲液?

通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。第13页/共32页二.实验操作(1)红细胞的洗涤(2)血红蛋白的释放(3)分离血红蛋白溶液样品处理粗分离纯化纯度鉴定透析除去分子较小的杂质通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度第14页/共32页

二、实验操作1.样品处理：（二）操作过程

本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。用鸡的红细胞提取DNA，用哺乳动物的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。第15页/共32页1.洗涤红细胞洗涤过程：血液100mL3g柠檬酸钠低速离心2min红细胞血浆吸出血浆红细胞5倍体积生理盐水搅拌10min重复洗涤3次，直至上清液没有黄色速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果第16页/共32页1.洗涤红细胞阅读思考：洗涤的目的是什么？除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化第17页/共32页2.释放血红蛋白阅读思考：释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？2.为了加速释放过程，采取了什么措施？目的分析：蒸馏水的作用是______________________________。加入甲苯的作用是____________________________。充分搅拌的目的是____________________________。使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂第18页/共32页3.分离血红蛋白分离过程红细胞破碎混合液高速离心10min离心管滤纸过滤脂类物质烧杯2000r/min的速度第19页/共32页(3)分离血红蛋白溶液：①过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以

2000r/min的速度离心10min。②试管中溶液层次：第1层（最上层）：甲苯层（无色

透明）；第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白

色薄层固体）；第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）；第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。③分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。

二、实验操作第20页/共32页2、血红蛋白的粗分离----透析：①过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的

磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。②透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。

实验操作原理：透析袋能使小分子自由进出，而大分子保留在袋内。第21页/共32页透析过程动画演示第22页/共32页纯化——凝胶色谱法1.凝胶色谱柱的制作2.凝胶色谱柱的装填3.样品的加入和洗脱第23页/共32页纯度鉴定使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。

第24页/共32页第25页/共32页观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。三.实验结果分析与评价1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？第26页/共32页由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？第27页/共32页如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。3、你能观察到蛋白质的分离过程中，红