Taqman探针设计要领课件

定量——

绝对标准曲线方法标准品：纯化的质粒dsDNA，体外转录的RNA

准确配制标准系列并且注意其稳定性，最好分装后保存于-80℃

荧光材料：杂交探针、水解探针或SYBRGreenI不可以使用DNA作为标准品对RNA进行定量应用于定量病毒荷载量等定量——

相对标准曲线方法指在测定目的基因的同时测定某一内对照基因，用一系列已知外参物做标准曲线，根据该标准曲线得到目的基因和内对照基因的量，再将目的基因的同内对照基因的比值作为定量的最后结果标准品：含有目标基因的DNA或RNA一般选用看家基因校正常选择看家基因GAPDH、β-actin、rRNA在假设样品逆转录效率相同的前提下，可以使用DNA的标准曲线对RNA进行定量较常用的一种方法比较Ct法

假设目的基因与看家基因扩增效率相同，数学推导得出目的基因的量=2-ΔΔCt

ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)实验组-(Ct目的基因-Ct管家基因)对照

2-ΔΔCt表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数在目的基因与看家基因扩增效率相同的情况下可以直接得到的目的基因相对于管家基因的定量，而不必制作标准曲线

更为简便省时，也是相当可靠的影响敏感度的因素

反应体系中形成的引物二聚体的影响可以用水解探针代替SYBRGreenI，有文献报导使用水解探针的敏感性要比SYBRGreenI高出10倍。可以使用热启动办法或使用特殊处理的Taq酶要尽可能地优化引物设计如果反应体系中出现PCR的抑制因素，应适当将目的基因的浓度稀释后再进行扩增。注意避免室温混合各种试剂，并且在一经混合后立即开始进行扩增。循环数Mg2＋的浓度

应用对各种基因表达进行定量分析基础研究：不同组织、用药前后、不同发育阶段基因表达差异的检测临床：细菌、病毒、寄生虫等病原体的检测

DNA、mRNA病毒荷载量的定量肿瘤相关基因、肿瘤标志物和肿瘤耐药基因的检测食品卫生检疫：转基因食品瘟疫流行地区进口的食品点突变分析和等位基因分析单核苷酸多态性（SNP）分析DNA甲基化检测如何设计荧光定量PCR实验方案根据拟要研究的基因名称，在genebank中找到相应的基因序列（）采用引物设计软件PrimerExpress2.0(Taqman探针或SYBRGreenI，说明见

)和beacondesigns3.0进行引物探针的设计

软件可在下载

PCR产物大小在50-150bpTaqMan探针设计原则保持G-C含量在30-80%之间避免同一碱基重复过多。特别是G，不可超过4个及以上5’不能是G尽量使探针中的C多于G上述两条如果不能满足，则使用互补链上的探针对于单探针反应，用PrimerExpress软件计算出来的Tm值应当在68-70℃之间，比引物高10℃。长度<30bp引物和探针的设计原则的重要程度由上往下越来越低如果是设计SYBRGreenI引物，也要选择TaqManPrimerandProbedesign并遵守这些规则，但是只需要合成引物就可以了。为了确保引物和探针的特异性，最好将设计好的序列在中核实一次，如果发现由非特异性互补区，建议重新设计引物探针。如何设计荧光定量PCR实验方案根据仪器和个人的喜好，确定荧光定量PCR的方法，选择荧光素的种类合成引物和探针收集样品、提取RNA或DNA（-80℃保存，避免反复冻融

）制备标准品（质粒、化学