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文档简介

实验三质粒提取与电泳【实验目的】

通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的方法。【实验原理】

碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH值4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此，复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此己完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA分子与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。(二)材料1.葡萄糖2.三羟甲基氨基甲烷（Tris）3.乙二胺四乙酸(EDTA)4.氢氧化钠5.十二烷基硫酸钠(SDS)6.乙酸钾7.冰乙酸8.氯仿9.乙醇10．胰RNA酶11．氨苄青霉素12．蔗糖13．溴酚蓝14．酚15.含pUC19质粒的大肠杆菌16．吸头、小指管(三)试剂1.溶液I50mmol/L葡萄糖

25mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）Tris·HCl(pH8.0)10mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)2.溶液II0.4mol/LNaOH,2%SDS,用前等体积混合3.溶液III5mol/L乙酸钾60mL

冰乙酸11.5mL

水28.5mL4.TE缓冲液

10mmoL/LTris·HCl(pH8.0)1mmoL/LEDTA(pH8.0)5.70%乙醇(放-20℃冰箱中,用后即放回)6.胰RNA酶将RNA酶溶于10mmoL/LTris·HCl(pH7.5)、15mmoL/LNaCl中,配成10mg/mL的浓度,于100℃加热15min,缓慢冷却至室温,保存于-20℃。7.凝胶加样缓冲液（6X）：40%蔗糖、0.25%溴酚兰。5.加200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管盖，混匀内溶物，将离心管放冰上5min。6.加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置15min。7.12000r/min离心15min，将上清转至另一离心管中。8.向上清中加入等体积酚:氯仿（1:1）或氯仿:异戊醇(24:1)（去蛋白），反复混匀，12000r/min离心5min，将上清转移到另一离心管中。9.向上清中加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置5～10min。12000r/min离心5min。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。10.用1mL70％乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。11.加50μLTE缓冲液，(其中含有20μg/mL的胰RNA酶)，使DNA完全溶解，-20℃保存。12.紫外分光光度计测定DNA样品浓度(1μLDNA+49μL

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