中国药科大学生化设计性实验报告参考-菠萝蛋白酶的提取和活力测定课件

从菠萝中提取菠萝蛋白酶微生物09301班第三实验小组成员：徐雨婷杨洋刘杨何威刘鄂龙一、实验目的

1、掌握从原料物中提取分离目的蛋白酶；

2、掌握对目的蛋白酶质量的检验；

3、学习酶比活力的计算；二、实验基本原理

菠萝蛋白酶是一种具有消炎，抗水肿作用的疏基酶，能分解蛋白质、酯和酞胺。菠萝蛋白酶一般从菠萝汁或菠萝废皮中提取，为浅黄色无定形粉末，分子量33000，微有异臭，微溶于水，不溶于乙醇、丙酮、氯仿，乙醚，等电点9.55。本实验先从新鲜的菠萝汁中使用有机酸（单宁）沉淀法提取出菠萝蛋白酶，然后通过考马斯亮蓝法测定酶制品中菠萝蛋白酶的总量，最后菠萝蛋白酶将酪蛋白水解产生酪氨酸，通过在275nm波长下测定吸光度的变化，可以测得菠萝蛋白酶的活力。三、实验材料和试剂

1、实验材料

新鲜菠萝(0.735kg)、0.1mg/ml牛血清蛋白

2、实验试剂柠檬酸钠维生素c单宁0.1%EDTA溶液1.5%氯化钠溶液1%酪蛋白溶液1mol/L氢氧化钠溶液0.05mol/L磷酸缓冲液（溶解磷酸二氢钾，加氢氧化钾调PH至7.0）激活剂（PH7.0，0.05mol/L磷酸缓冲液，内含15mmol/L硫代硫酸钠和6mmol/LEDTA-2Na,现配现用）五、实验操作方法法和步骤（一）从菠萝中提取菠萝蛋白酶操作步骤：将菠萝切碎加柠檬酸钠，榨汁菠萝汁纱布过滤澄清液2000r/min，7min离心上清液沉淀物酶复合物酶复合物沉淀加Vc,0.2%单宁溶液搅拌15min,静置40min4200r/min,5min离心加100ml0.1%EDTA溶液，200ml1.5%氯化钠液4200r/min,5min离心加适量1.5%氯化钠溶液，4000r/min,7min离心冻存备用（二）考马斯亮蓝法测定酶制品中蛋白酶含量1、标准曲线的制作按下表操作根据上表，以吸光度为纵坐标，标准蛋白质量为横坐标作图根据线性拟合关系y=6.2357x,计算蛋白酶的质量（三）菠萝蛋白酶活力的测定1、取酶制品溶解于0.05mol/L磷酸缓冲液（PH7.0)至10ml,离心得上清液；2、取5支试管，分别标号1、2、3、4、5，各加1ml溶液酶和0.9m激活剂；3、另取5支试管，分别对应标号、、、、，各加1ml缓冲液和0.9ml激活剂；4、将10支试管置于37℃水浴；5、然后按下表操作（四）数据的处理1、由线性关系y=6.2357x，可以计算酶制品中蛋白酶的总质量m=0.140/6.2357x5=0.1123mg2、菠萝蛋白酶活力=0.868/10=0.0868U3、比活力=0.0868U/0.1123mg=0.7729U/mg4、提取率=0.1123mg/0.735kg=0.00001528%（五）结果讨论从上述结果可知菠萝蛋白酶的比活力较低，可能的原因有：1、所加入的有机酸单宁的量对菠萝蛋白酶沉淀有的影响；2、在实验中是否把单宁溶液弄混而导致菠萝蛋白酶很少沉淀析出；3、菠萝蛋白酶对热不稳定，试验中温度的控制是否合理；4、在活力测定的步骤中所加入的酪蛋白的量不足，导致结果偏低；5、在活力的测定步骤中，设置了几个梯度，最后的结果中应该有至少两支