酶与细胞的固定化技术

酶与细胞的固定化技术第1页，共61页，2023年，2月20日，星期二酶应用过程中的一些不足酶的稳定性较差：除了某些耐高温的酶，如α-淀粉酶等；和胃蛋白酶等可以耐受较低的pH条件以外，大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活。酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中与底物反应，这样酶在反应系统中，与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用。这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产。产物的分离纯化较困难：酶反应后成为杂质与产物混在一起，无疑给产物的进一步的分离纯化带来一定的困难。

固定化技术第2页，共61页，2023年，2月20日，星期二酶的固定化

1、什么是固定化技术和固定化酶2、固定化酶的研究历史3、酶的固定化技术4、固定化酶的特点GoGoGoGo第3页，共61页，2023年，2月20日，星期二

固定化生物技术——

通过化学或物理的手段将酶或游离细胞定位于限定的空间区域内，使其保持活性并可反复利用。第4页，共61页，2023年，2月20日，星期二1.酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有机溶剂对其有影响）。2.不能回收，也使产物中混杂酶蛋白。3.分离纯化困难。

游离酶的缺点：第5页，共61页，2023年，2月20日，星期二什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性载体水不溶性酶（固定化酶）固定化技术第6页，共61页，2023年，2月20日，星期二固定化酶固定化酶：是指借助物理或化学方法将酶固定在载体上，并在一定的空间内进行催化反应的酶。固定化酶可以连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。固定化酶形状：颗粒、线条、薄膜和酶管等。固定化菌体优点：1）可提高稳定性；2）能回收，易与产物分离，可反复使用；3）可连续化生产操作；4）可实现最优化控制；5）酶可以再生利用。缺点：1）酶固定化后酶活力有损失；2）只能用于可溶性小分子底物；3）与完整细胞比较，不适于多酶反应。第7页，共61页，2023年，2月20日，星期二制备固定化酶的依据固定化酶必须能保持酶原有的专一性、高效催化能力和常温、常压下能起催化反应等特点。固定化酶应能回收、贮藏，利于反复使用。固定化酶应用于机械化和自动化操作，所用载体常有一定的机械强度。固定化酶应能保持甚至超过原有酶液的活性。即要保护活性中心基团。固定化酶应能最大程度与底物接近，从而提高产量。具有最小的空间位阻。固定化酶应有最大的稳定性。定化酶应易与产物分离。第8页，共61页，2023年，2月20日，星期二固定化方法

吸附法

结合法

交联法

包埋法网格型微囊型共价键结合法离子键结合法酶的固定化方法第9页，共61页，2023年，2月20日，星期二1、吸附法

利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上，而使酶固定化的方法。常用的固体吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。操作简便，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，而且可反复使用。由于靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体结合不牢固而容易脱落，所以使用受到一定的限制。

第10页，共61页，2023年，2月20日，星期二优点：条件温和，操作简便，酶活力损失少。缺点：结合力弱，易解吸附。第11页，共61页，2023年，2月20日，星期二2、结合法选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法。根据酶与载体结合的化学键不同，可分为：离子键结合法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法。离子键结合法所使用的载体是某些不溶于水的离子交换剂。常用的有DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。共价键结合法：通过共价键将酶与载体结合的固定化方法称为共价键结合法。共价键结合法所采用的载体主要有：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质、氨基酸共聚物、甲基丙稀醇共聚物等。酶分子中可以形成共价键的基团主要有：氨基、羧基、巯基、羟基、酚基和咪唑基等。要使载体与酶形成共价键，必须首先使载体活化。第12页，共61页，2023年，2月20日，星期二第一个离子结合法固定化酶：

DEAE-Cellulose

固定化过氧化氢酶第一个工业化的固定化酶：

DEAE-SephadexA-50

固定化氨基酰化酶第13页，共61页，2023年，2月20日，星期二

借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基团进行偶联。共价结合法（covalentbindingorcovalentcoupling）

第14页，共61页，2023年，2月20日，星期二1）载体：亲水载体优于疏水载体

如:天然高分子衍生物:

纤维素葡聚糖凝胶亲和性好，机械性能差琼脂糖合成聚合物：聚丙烯酰胺 聚苯乙烯机械性能好，但有疏水结构尼龙第15页，共61页，2023年，2月20日，星期二

使载体活化的方法很多，主要的有：重氮化法、叠氮法、溴化氰法、烷基化法等。第16页，共61页，2023年，2月20日，星期二优点：酶与载体结合牢固，不会轻易脱落，可连续使用。缺点：反应条件较激烈，易影响酶的空间构象而影响酶的催化活性。

第17页，共61页，2023年，2月20日，星期二3、交联法借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。戊二醛有两个醛基，这两个醛基都可与酶或蛋白质的游离氨基反应，形成席夫（Schiff）碱，而使酶或菌体蛋白交联，制成固定化酶或固定化菌体。交联反应既能发生在分子间，也可发生在分子内。酶浓度低时，交联发生在分子内，酶仍保持溶解状态。酶浓度高时，交联发生在分子间，酶变为不溶态。交联法制备的固定化酶或固定化菌体结合牢固，可以长时间使用。但由于交联反应条件较激烈，酶分子的多个基团被交联，致使酶活力损失较大，而且制备成的固定化酶或固定化菌体的颗粒较小，给使用带来不便。为此，可将交联法与吸附法或包埋法联合使用，以取长补短。常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。其中应用最广泛的是戊二醛。第18页，共61页，2023年，2月20日，星期二酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶第19页，共61页，2023年，2月20日，星期二

缺点：(1)反应条件激烈，酶分子的多个基团被交联，酶活力损失大。(2)制备的固定化酶颗粒较小，给使用带来不便。

第20页，共61页，2023年，2月20日，星期二4.包埋法

将酶用物理的方法包埋在各种载体（高聚物）内。分为：网格型：将酶包埋在高分子凝胶细微网格中。微囊型：将酶包埋在高分子半透膜中。第21页，共61页，2023年，2月20日，星期二1）网格型包埋法（gel(lattic)entrapment）又称凝胶包埋法凝胶包埋条件酶活性强度天然凝胶琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶温和不变差合成凝胶聚丙烯酰胺、光交联树脂聚合反应部分失活高使用的多孔载体及其特点第22页，共61页，2023年，2月20日，星期二海藻酸钙凝胶包埋法：滴至海藻酸钠溶液＋E(orcell)CaCl2溶液中IE(orIC)

角叉菜胶包埋法：滴至角叉菜胶＋E(orcell)KCl

溶液中IE(orIC)聚丙烯酰胺凝胶包埋法：

APAcr+Bis+E(orcell)IE(orIC)TEMED第23页，共61页，2023年，2月20日，星期二2）微囊型包埋法（microencapsulation）

又称半透膜包埋法将一定量酶液包在半透性的高分子微孔膜内。半透膜：直径几十微米到几百微米，厚约25nm。半透膜孔径<酶分子孔径，小于半透膜孔径的小分子底物和产物可以自由进出，被称为“人工细胞”。第24页，共61页，2023年，2月20日，星期二

与网格型包埋法相比，微囊型包埋法的优点：1）固定化酶颗粒小，有利于底物和产物扩散。2）半透膜能阻止蛋白质分子渗漏和进入，注入体内既可避免引起免疫过敏反应，也可使酶免遭蛋白水解酶的降解，具有较大的医学价值。缺点：反应条件要求高,制备成本也较高。

第25页，共61页，2023年，2月20日，星期二

包埋法是目前应用最多的一种较理想的方法，与其它固定化方法相比：优点：不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率高。缺点：只适合作用于小分子底物和产物的酶。第26页，共61页，2023年，2月20日，星期二

吸附法结合法交联法包埋法

酶的四种固定化方法第27页，共61页，2023年，2月20日，星期二第28页，共61页，2023年，2月20日，星期二第29页，共61页，2023年，2月20日，星期二固定化方法吸附法包埋法结合法交联法制备难易易较难难较难结合程度弱强强强活力回收高，酶易流失高低中等再生可能不能不能不能费用低低高中等底物专一性不变不变可变可变各种固定化方法的优缺点比较第30页，共61页，2023年，2月20日，星期二固定化酶性质固定化对酶稳定性影响：1）对热稳定性提高；2）对变性剂、抑制剂的耐受性提高；3）对蛋白酶抵抗能力增加、储存稳定性和操作稳定性有所增强。最适温度：一般与游离酶相似。最适pH：受载体带电性和产物性质等最适pH会受一定影响。底物特异性：是否变化与底物的分子质量大小有一定关系。米氏常数：固定化酶的表观米氏常数随载体带电性能而变化。第31页，共61页，2023年，2月20日，星期二固定化酶操作的注意事项活性中心：保护酶的催化作用，并使酶的活性中心的氨基酸基团固有的高级结构不受到损害，在制备固定化酶时，需要在非常严密的条件下进行。功能基团：如游离的氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基等，当这些功能基团位于酶的活性中心时，要求不参与酶的固定化结合酶的高级结构：要避免用高温、强酸、强碱等处理，而且有机溶剂、高浓度的盐也会使酶变性、失活，因此，操作应尽量在非常温和的条件下进行。第32页，共61页，2023年，2月20日，星期二分类方式固定化细胞分类方式固定化细胞细胞类型微生物植物动物生理状态死细胞:完整细胞,细胞碎片,细胞器活细胞:增殖细胞,静止细胞,饥饿细胞细胞的固定化方法第33页，共61页，2023年，2月20日，星期二

1)直接固定法

不使用载体，借助物理（如加热、冰冻）、化学方法（如柠檬酸、各种絮凝剂）将细胞直接固定。一般只用于单酶或少数几种酶催化的反应。

2)吸附法

3)包埋法

2.固定化方法第34页，共61页，2023年，2月20日，星期二

与固定化酶相比，固定化细胞的情况比较复杂。（1）有活性升高的现象。（2）稳定性的增加。（3）最适温度和最适pH常保持不变。固定化细胞的特点

第35页，共61页，2023年，2月20日，星期二固定化酶（细胞）的评价指标（一）固定化酶（细胞）活力：固定化酶通常呈颗粒状，一般用于测定自然酶活力的方法改进后才能用于测定固定化酶。通常采用间歇测定和连续测定方法。蛋白总量：1）双辛可宁酸法(BCA法)；2）考马斯亮蓝法。半衰期：在连续测定条件下，固定化酶(细胞)的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间，以t1/2表示，是衡量稳定性的一项重要指标。第36页，共61页，2023年，2月20日，星期二

如果耦联率与酶活力回收率相近，则表明固定化方法对酶活力没有明显影响。固定化酶（细胞）的评价指标（二）偶联率=(加入蛋白活力一上清液蛋白活力)/加入蛋白活力×100%活力回收率=固定化酶总活力/加入酶的总活力×100%相对活力=固定化酶总活力/(加入酶的总活力-上清液中未偶联酶活力)×100%第37页，共61页，2023年，2月20日，星期二乙酰-DL—AlaL—Ala+乙酸 乙酰-D—Ala固定化酶与固定化细胞的应用

一、在工业生产上的应用

1.氨基酰化酶（Aminoacylase）世界上第一种工业化生产的固定化酶第38页，共61页，2023年，2月20日，星期二泵储罐反应产物离心机消旋反应器固定化酶柱子晶体L-AlaL-AlaA-D-AlaA-L-AlaA-D-Ala第39页，共61页，2023年，2月20日，星期二

2.葡萄糖异构酶世界上生产规模最大，应用最为成功的一种固定化酶。第40页，共61页，2023年，2月20日，星期二二、固定化酶在医学上的应用

1.消血栓：纤溶酶是异源蛋白质，在人体内引起免疫反应，无法长期使用。酶的不稳定性使其在较短的时间内失活。用包埋法制备的酶固定化技术可克服上述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物质能自由进出。第41页，共61页，2023年，2月20日，星期二2.人工肾：原理：将病人血液中的尿素经脲酶水解成氨，再用活性炭吸附。即：用固定化脲酶和微胶囊活性炭组成人工肾。第42页，共61页，2023年，2月20日，星期二酶传感器

固定化酶和电化学传感器的结合。优点：①既有不溶性酶体系的优点，又具有电化学电极的高灵敏度；②酶的专一反应性，使其具有较高的选择性，能够直接在复杂试样中进行测定。三、在分析检测中的应用第43页，共61页，2023年，2月20日，星期二SensitiveandspecificRapidSimpleBiosensor第44页，共61页，2023年，2月20日，星期二

1967年Updike等采用酶的固定化技术，将葡萄糖氧化酶固定在疏水膜上，然后再和氧电极结合，组装成了世界上第一个生物传感器——葡萄糖氧化酶电极。第45页，共61页，2023年，2月20日，星期二

葡萄糖酶电极

酶电极示意图ß－D－葡萄糖＋O2 D－葡萄糖酸－1，5－内酯＋H2O2半透膜酶胶层感应电极第46页，共61页，2023年，2月20日，星期二GlucoseGluconicacidGlucoseoxidaseOxygenHydrogenperoxideMembraneElectrode

根据反应中消耗的O2、生成的葡萄糖酸和H2O2的量，可以用氧电极、pH电极和H2O2电极来测定葡萄糖的含量。第47页，共61页，2023年，2月20日，星期二继酶传感器（enzymesensor）后，又出现：细胞器传感器（cellorganellesensor）组织传感器（tissuesensor）微生物传感器（microbesensor）免疫传感器（immunosensor）第48页，共61页，2023年，2月20日，星期二1）酶传感器的原理生物传感器

由生物识别单元（如酶、微生物、抗体等）和物理转换器相结合所构成的分析仪器。第49页，共61页，2023年，2月20日，星期二生物识别元件

(Biologicalrecognitionelement)

是酶、抗原(体)、细胞器、组织切片和微生物细胞等生物分子经固定化后形成的一种膜结构，对被测定的物质有选择性的分子识别能力。第50页，共61页，2023年，2月20日，星期二

换能器(Transducer)

将识别元件上进行的生化反应中消耗或生成的化学物质，或产生的光或热等转换为电信号，并呈现一定的比例关系。第51页，共61页，2023年，2月20日，星期二第52页，共61页，2023年，2月20日，星期二酶传感器工作原理示意图酶传感器主要由固定化酶膜和变换器组成：固定化酶膜：选择性地“识别”并催化被检测物质发生化学反应；变换器：把催化反应中底物或产物的变量转换成电信号，通过仪表显示出来。

第53页，共61页，2023年，2月20日，星期二第54页，共61页，2023年，2月20日，星期二2）酶传感器的应用

水质监