生物化学篇专题篇基因诊断与基因治疗

生物化学篇专题篇基因诊断与基因治疗第1页/共70页基因(gene)

基因是为生物活性产物编码的DNA功能片断，这些产物主要是蛋白质或各种RNA。第2页/共70页基因变异致病类型内源基因的变异基因结构突变基因表达异常外源基因的入侵第3页/共70页第一节基因诊断GeneDiagnosis第4页/共70页

（二）、分类

DNA诊断—以DNA为检测对象的诊断方法。

RNA诊断—以mRNA为检测对象的诊断方法。一、基因诊断的概念和特点

（一）、定义利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。第5页/共70页（三）、特点针对性强特异性高灵敏度高适用性强，诊断范围广第6页/共70页二、基因诊断常用技术方法

（一）、核酸分子杂交技术（二）、聚合酶链反应（三）、基因测序（四）、基因芯片（五）、DNA指纹第7页/共70页（一）、核酸分子杂交(molecularhybridization)技术

核酸分子杂交可用以检测样本中是否存在与探针序列互补的同源核酸序列。

核酸探针是一类具有放射性标记或化学标记的并与目的目的DNA或RNA分子序列互补的寡核苷酸片段。

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探针是能够同某种待研究的核酸序列或蛋白多肽链特异结合的任何分子，经标记之后可用来检测目的DNA/RNA或蛋白质分子。

实验流程：提取DNA→(限制酶切)→凝胶电泳→膜转移→杂交→放射自显影→分析第9页/共70页建立在核酸杂交技术基础上的常用基因诊断方法1、限制性内切酶(restrictionendonuclease)酶谱分析法2、DNA限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)分析法3、等位基因特异寡核苷酸(allelespecificoligonucleotide,ASO)探针杂交法第10页/共70页1、限制性内切酶酶谱分析法

是利用限制性内切酶和特异性DNA探针来检测是否存在基因变异的一种方法。第11页/共70页×MstⅡ酶切位点(CCTNAGG)5´3´正常基因5´3´突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析A→T

第12页/共70页+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突变携带着患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析第13页/共70页2、DNA-RFLP分析法

中性突变是指在人基因组中，平均每200对碱基可发生一对变异的现象。

DNA多态性是指中性突变导致个体间核苷酸序列的差异。限制性片段长度多态性是指DNA多态性若发生在限制性内切酶识别位点上，酶切水解该DNA片段就会产生长度不同的片段。第14页/共70页RFLP分析法第15页/共70页3、ASO杂交法

根据已知基因突变位点的核苷酸序列，人工合成相应于正常和突变基因碱基序列的两种寡核苷酸探针，用它们分别与受检者DNA进行分子杂交来检测是否存在等位基因突变。第16页/共70页ASO杂交法探针：MNMNMNMN

正常基因纯合突变杂合突变基因缺陷（新的突变类型？）+﹣第17页/共70页（二）、聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)

是利用特异的引物，特异地扩增目的DNA的方法。实验流程：提取DNA→PCR→凝胶电泳→显色→分析第18页/共70页5Primer15Primer2Cycle2Cycle1555555TemplateDNA555555551、基本工作原理第19页/共70页Cycle3555555555555555525～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。第20页/共70页2、常用的PCR方法：

常规PCR、巢式PCR、多重PCR、多种PCR、不对称PCR、反转录PCR、定量反转录PCR、mRNA差异显示PCR、原位PCR、实时PCR等等。第21页/共70页3、在PCR技术基础上的常用基因诊断方法PCR-SSCP法*PCR-ASO法PCR-RFLP法PCR-限制酶谱法PCR-STR（短串联重复序列，shorttandemrepeat）第22页/共70页

SSCP是指相同长度的单链DNA因其碱基序列不同，甚至单个碱基不同，都可能形成不同的空间构象，从而在中性聚丙烯酰胺凝胶电泳时泳动速率不同的现象。

单链构象多态性(singlestrandconformationpolymorphism,SSCP)第23页/共70页PCR-SSCP分析

是指PCR产物变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常基因和变异基因的迁移位置不同，借此可分析确定致病基因的存在。第24页/共70页正常人纯合突变杂合突变Leber遗传性神经病患者PCR/SSCP分析

（线粒体DNA第11778位G→A所致）+﹣第25页/共70页（三）、基因测序(genesequencing)

即测定某一基因的碱基序列。实验流程：提取DNA→分离出有关基因→测序→分析诊断

基因测序的方法：化学裂解法DNA链末端合成终止法DNA自动测序第26页/共70页（四）、基因芯片（genechip)

基因芯片，又称DNA芯片、DNA阵列、寡核苷酸微芯片（DNAchip、DNAarrays、oligonucleotidemicro-chip）—是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，然后与待测的标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交，再通过激光聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测，从而迅速得出定性和定量的结果。第27页/共70页第28页/共70页基因芯片的应用1、在诊断中的应用核酸序列分析、基因表达分析、寻找新基因、突变基因和基因多态性检测等2、在药学研究中的应用药物筛选、药物作用机制研究、耐药菌株、药敏检测、毒理学研究、环境化学毒物的筛选、基因扫描等第29页/共70页（五）、DNA指纹(DNAfingerprint)

在人基因组DNA中有高度可变的“小卫星”区域，采用“小卫星”基因探针，在同一限制酶切产物的DNA杂交图谱上，同一个体不同组织来源的DNA的谱带完全一致，而不同个体之间（同卵双生除外）谱带都不相同，如同人的指纹具有高度个体特异性一样，因此这种杂交图谱被称为DNA指纹或遗传指纹（geneticfingerprint）。第30页/共70页

简言之：DNA指纹或遗传指纹是指采用“小卫星”基因探针进行DNA分子杂交（Southern

印迹，Southernblotting）所得的图谱。

实验流程：提取DNA→限制酶切→凝胶电泳→膜转移→杂交→放射自显影→分析第31页/共70页三、基因诊断的应用遗传疾病肿瘤感染性疾病传染性流行病判断个体疾病易感性器官移植组织配型法医学中个体识别、亲子鉴定第32页/共70页总结

基因诊断的概念、特点、常用的技术方法及应用。第33页/共70页复习题1、名词解释：基因诊断、DNA诊断、RNA诊断、RFLP分析、SSCP、基因芯片、DNA指纹2、简述基因诊断的特点、常用技术方法及可用于诊断的疾病。简述基因变异致病的类型及内源性基因变异的类型。简述限制性内切酶谱分析法、ASO探针杂交法、PCR-SSCP分析、基因芯片、DNA指纹等的实验流程。第34页/共70页第二节基因治疗GeneTherapy第35页/共70页（一）、基因治疗的概念早期是指用正常的基因整合入细胞基因组，以校正和置换致病基因的一种治疗方法。目前广义上来讲是指将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法。一、基因治疗的概念第36页/共70页（二）、基因治疗的基本方法1、基因矫正(genecorrection)2、基因置换(genereplacement)3、基因增补(geneaugmentation)4、基因失活(geneinactivation)第37页/共70页

1、基因矫正(genecorrection)

指将致病基因的异常碱基进行纠正，而正常部分予以保留。纳米钳第38页/共70页AGCTGTGAAGTCGTGTCGACACTTCAGCACabnormalgeneGenecorrectionnormalgeneTACG第39页/共70页2、基因置换(genereplacement)

指用正常的基因通过体内基因同源重组，原位替换致病基因，使细胞内的DNA完全恢复正常状态。第40页/共70页AGCTGTGC

AAGTCGTGTCGACACG

TTCAGCACnormalgeneAGCTGTGCAAGTCGTGTCGACACGTTCAGCACnormalgeneAGCTGTGT

AAGTCGTGTCGACACATTCAGCACabnormalgeneGenereplacement第41页/共70页3、基因增补(geneaugmentation)

将目的基因导入病变细胞或其他细胞，不去除异常基因，而是通过目的基因的非定点整合，使其表达产物弥补缺陷基因的功能或使原有基因表达增强。第42页/共70页AGCTGTGC

AAGTCGTGTCGACACG

TTCAGCACnormalgeneAGCTGTGT

AAGTCGTGTCGACACA

TTCAGCACabnormalgeneGeneaugmentation第43页/共70页4、基因失活(geneinactivation)

指将特定的序列导入细胞后，在转录或翻译水平阻断某些基因的异常表达，已达到治疗疾病的目的。第44页/共70页几种常见的基因失活技术反义核酸技术核酶技术三链技术干扰RNA技术肽核酸基因敲除第45页/共70页①反义(antisence)核酸技术

是指用人工合成的RNA或DNA来阻断基因的转录或复制，使编码基因不能转录为mRNA，因而不能翻译成相应的蛋白质。第46页/共70页反义RNA技术

反义RNA是指与mRNA互补，且能抑制与疾病发生直接相关基因表达的RNA。反义RNA技术是指利用反义RNA在mRNA水平上封闭基因表达，最终可通过调节剂量，来治疗由基因突变或过度表达所致的疾病或严重感染性疾病。

第47页/共70页TCGACACA

TTCAGCACAGCTGTGT

AAGTCGTGabnormalgeneGeneinactivationabnormalmRNAUCGACACAUUCAGCAC反义RNA

AGCUGUGUAAGUCGUGAbnormalproteinAbnormalprotein第48页/共70页②核酶(ribozyme)技术

通过核酶分子结合到靶RNA分子中适当的部位，形成锤头核酶结构，催化对靶RNA分子的剪切，从而破坏靶RNA分子达到治疗疾病的目的。第49页/共70页5’3’5’3’靶RNA核酶分子核酶技术第50页/共70页③三链技术(triplexapproach)

又称为反基因策略(antigenestragegy)，是利用脱氧寡核苷酸能与双螺旋双链DNA专一性序列结合，形成三链DNA，从而在转录水平或复制水平阻止基因转录或复制的技术。能形成三链DNA的脱氧寡核苷酸称为三链DNA形成脱氧寡核苷酸（triplex-formingoligonucleotide,TFO)。第51页/共70页复制、转录三链DNA技术第52页/共70页④干扰RNA(interferenceRNA,RNAi)技术

RNAi是指在特定因子作用下，有导入胞内的双链RNA降解生成的约22nt左右的SiRNAs(singlestrandRNAi)。

RNAi技术是指利用碱基互补配对原则，使RNAi和靶DNA结合，同时诱导激活体内的基因沉默因子，从而使靶DNA降解。第53页/共70页dsRNARNAi-DNARNA、DNA降解干扰RNA技术RNAi第54页/共70页RNAi技术的特点特异性强效率性高作用时间长可通过细胞屏障而发挥作用第55页/共70页⑤肽核酸(peptidenucleicacid,PNA)技术PNA是指DNA-肽复合物。

PNA技术是利用多肽与DNA的特异性结合，专一地抑制某一基因的表达。第56页/共70页肽肽核酸技术第57页/共70页⑥基因敲除(geneknock-out)技术

指有目的的去除动物体内某种基因的技术。第58页/共70页（三）、基因治疗的其他方法1、“自杀基因”的应用某些病毒或细菌的基因所表达的酶能将对人体无毒或低毒的药物前体在人体细胞内转变为细胞毒性产物，从而导致携带该基因的受体细胞也被杀死，故称这类基因为自杀基因。自杀基因无毒、低毒的药物前体→→

→细胞毒性产物→细胞死亡第59页/共70页2、基因疫苗的应用将编码外源性抗原的基因插入到含真核表达系统的质粒上，然后将质粒直接导入人或动物体内，让其在宿主细胞内表达抗原蛋白，诱导机体产生免疫应答。第60页/共70页重组表达质粒外源性抗原基因基因疫苗第61页/共70页二、基因治疗的基本程序一、治疗性基因的选择目的基因的选择二、基因载体的选择三、靶细胞的选择四、基因转移五、外源基因表达的筛选

利用载体中的标记基因有neor标记基因时，用418进行筛选六、回输体内静脉回输自体骨髓移植埋入皮下组织病毒载体**非病毒载体体细胞生殖细胞间接体内疗法(exvivo)直接体内疗法(invivo)第62页/共70页第63页/共70页

常见基因载体的优缺点载体优点缺点逆转录病毒基因组小并且简单仅感染分裂细胞稳定整合于宿主基因组随机整合可能导致突变生物学特性清楚常常只有短暂表达可高效转入复制中的细胞病毒滴度低107pfu/ml

对宿主无害可能会于有复制能力的病毒重组腺病毒相关病毒基因组小未知可特异整合于人染色体19q需腺病毒辅助复制以人细胞作为宿主携带外源基因能力有限无毒，无致病性难得到高滴度病毒第64页/共70页腺病毒适用于原位使用，尤其是肺不与宿主基因整合在不分裂细胞中可进行高效率只有短暂表达的体内感染