生物化学　DNA复制　RNA转录

生物化学DNA复制RNA转录第1页/共111页教学大纲了解:真核细胞与原核细胞DNA复制的不同：DNA损伤的类型及损伤后的修复；原核生物转录的基本过程；转录后加工、反转录和核酶的概念；RNA干扰技术及基因治疗相关内容(加)掌握：DNA合成的方式------半保留复制；合成特点：半不连续复制；DNA复制的过程所需要的物质(酶，尤其是原核生物-大肠杆菌DNA聚合酶的种类及作用，掌握其他(复制所需要的)酶或蛋白需要名称及种类，了解其功能)；掌握原核生物转录的基本过程、概念和特点；重点、难点：DNA合成的方式—半保留复制；DNA复制的过程(前导链与滞后链的合成异同点及所需要的酶)；掌握转录与复制的异同点。RNA剪接及加工过程(以前是了解内容)第2页/共111页单击画面继续DNA转录翻译复制逆转录RNA复制RNA蛋白质为什么子女与父母非常相象？基因就是指DNA中能编码蛋白质和功能RNA的特定核苷酸序列。第3页/共111页第一节DNA的生物合成一、DNA复制方式二、参与DNA复制的因子三、DNA复制过程四、逆转录五、DNA损伤的修复单击画面继续第4页/共111页一、DNA的复制方式单击画面继续

半保留复制(semiconservativereplication)----在DNA复制过程中，双螺旋结构解开而成为单链，分别以DNA双螺旋中的一条链为模板，按碱基互补配对的原则合成两条新的互补链。这样新合成的DNA双链中一股单链是从亲代完整地接受过来的，另一股单链完全重新合成。第5页/共111页DNA半保留复制的证据

单击画面继续第6页/共111页几个相关概念：

1.复制起始点

(origin,ori)

原核生物只有一个复制起始点； 真核生物染色体DNA有多个复制起始点，同时形成多个复制单位，两个起始点之间的DNA片段称为复制子(replicon)。第7页/共111页

复制子第8页/共111页

2.复制叉

(replicationfork)

复制时双链打开，分开成两股，新链沿 着张开的模板生成，复制中形成的这种Y

字形的结构称为复制叉。第9页/共111页二、原核生物DNA复制的参与因子1.底物

dNTP(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)2.聚合酶DNA聚合酶I、II、III3.模板单链的DNA母链4.引物寡核苷酸引物（RNA)5.其他酶和蛋白质因子解链酶，解旋酶,单链结合蛋白，连接酶

单击画面继续第10页/共111页（一）DNA聚合酶的活性5′至3′的聚合活性5′→3′方向核酸外切酶活性5′→3′外切酶活性3′→5′外切酶活性单击画面继续第11页/共111页5′至3′的聚合活性（5′→3′）单击画面继续第12页/共111页

核酸外切酶活性

3′→5′外切酶活性5′→3′外切酶活性单击画面继续第13页/共111页大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ全酶的结构和功能延长因子DNA聚合酶Ⅲ两个亚基夹住DNADNA聚合酶Ⅲ异二聚体核心酶校对引物的结合和识别促使核心酶二聚化第14页/共111页（二）DNA拓扑异构酶(解旋酶）既能水解，又能打断碱基互补配对的氢键拓扑酶Ⅰ切断DNA双链中的一股拓扑酶Ⅱ切断DNA双链

（三）解链酶使复制差前方的双链截开一小段（四）单链DNA结合蛋白（SSB）维持模板处于单链状态保护单链的完整(五)引物酶是RNA聚合酶，合成一段RNA引物

单击画面继续第15页/共111页（六）DNA连接酶（ligase）催化两段DNA之间的连接单击画面继续第16页/共111页三、DNA的复制过程（一）复制的起始单击画面继续（二）复制的延伸

（三）复制的终止

第17页/共111页

1.DNA复制的起点

原核生物从一个固定的起始点开始，同时向两个方向进行的，称为双向复制单击画面继续θ复制原核生物DNA的复制（一）复制的起始第18页/共111页

2.复制叉的形成复制叉----复制开始后由于DNA双链解开，在两股单链上进行复制，形成在显微镜下可看到的叉状结构。单击画面继续第19页/共111页3.起始的过程打开DNA超螺旋打开双螺旋防止复螺旋单链结合蛋白解链酶引物复合体引物酶拓扑异构酶合成单击画面继续第20页/共111页DNA复制起始的过程拓扑异构酶解链酶单链结合蛋白DNA聚合酶引物酶及引发体DNA连接酶引物DNA双链′5′3′5′3单击画面继续第21页/共111页拓扑异构酶解链酶单链结合蛋白DNA聚合酶引物酶及引发体DNA连接酶引物DNA复制起始的过程拓扑异构酶与DNA双链结合，解开超螺旋。′5′3′5′3单击画面继续第22页/共111页拓扑异构酶解链酶单链结合蛋白DNA聚合酶引物酶及引发体DNA连接酶引物DNA复制起始的过程解链酶解开DNA双螺旋′5′3′5′3单击画面继续第23页/共111页拓扑异构酶解链酶单链结合蛋白DNA聚合酶引物酶及引发体DNA连接酶引物单链结合蛋白防止复螺旋′5′3′5′3单击画面继续DNA复制起始的过程第24页/共111页拓扑异构酶解链酶单链结合蛋白DNA聚合酶引物酶及引发体DNA连接酶引物DNA复制起始的过程引物酶合成引物′5′3′5′3单击画面继续第25页/共111页二、DNA复制的延伸单击画面继续1.DNA聚合酶把新生链的第一个脱氧核苷酸加到引物的3′-OH上，开始新生链的合成过程。AG

T

AC

TA

A

T

DNA聚合酶ACGACGTT引物第26页/共111页AG

T

AC

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A

T

AGCGACGGTTTT

组成

DNA的脱氧核糖核苷酸一个个连接起来单击画面继续3′,5′-磷酸二酯键引物第27页/共111页AG

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A

T

GCGACGGTTTTA单击画面继续引物第28页/共111页AG

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GCGACGTTGTTA单击画面继续引物第29页/共111页AG

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GCGACGTGTTAA单击画面继续引物第30页/共111页AG

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GCGACGGTTAAT单击画面继续引物第31页/共111页AG

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GGCGGTTAATATCDNA模板链单击画面继续DNA新链引物第35页/共111页单击画面继续DNA聚合酶DNA聚合酶2.冈崎片段冈崎片段冈崎用电子显微镜看到了DNA复制过程中出现一些不连续片段，这些不连续片段只存在与DNA复制叉上其中的一股。后来就把这些不连续的片段称为冈崎片段。第36页/共111页3.半不连续复制领头链随从链冈崎片段5′3′′5′3单击画面继续半不连续复制

DNA复制时,一条链是连续的,另一条链是不连续的,称为半不连续复制。第37页/共111页三复制的终止复制有终止信号polⅠ5′→3′外切酶活性水解引物polⅠ聚合活性填补空隙DNA连接酶连接缺口。单击画面继续第38页/共111页大肠杆菌三种DNA聚合酶比较DNA聚合酶Ⅱ分子量每个细胞的分子统计数5´-3´聚合酶作用3´-5´核酸外切酶作用5´-3´核酸外切酶作用转化率DNA聚合酶Ⅰ109，000400+++1120，000100++-0.05400，00010-20++-50比较项目DNA聚合酶III切除引物修复修复复制功能

1999年发现聚合酶和，它们涉及DNA的错误倾向修复（erroounerepair）第39页/共111页DNA忠实性的保障1、碱基的配对规律：模板链与新生链之间的碱基配对保证碱基配错几率约为1/104～1/105。2、DNA聚合酶的3’→5’外切酶活性的校对功能，使碱基的错配几率又降低100～1000倍。3、复制中的即时校读功能。4起始时以RNA作为引物第40页/共111页复制的忠实性

DNA复制过程是一个高度精确的过程，据估计，大肠杆菌DNA复制5109碱基对仅出现一个误差，保证复制忠实性的原因主要有以下三点:DNA聚合酶的高度专一性（严格遵循碱基配对原则，但错配率为710-6

）

DNA聚合酶的校对功能（错配碱基被3’-5’

外切酶切除）第41页/共111页DNA聚合酶的校对功能

5´-核酸外切酶3´-核酸外切酶裂缝聚合中心裂缝内部第42页/共111页DNA聚合酶的校对功能聚合酶错配硷基复制方向正确核苷酸5´5´5´3´3´3´切除错配核苷酸第43页/共111页起始时以RNA作为引物的作用

DNA复制为什么要合成一个RNA引物，而后又把这个引物消除呢？这是保证DNA聚合过程高度精确的又一措施。已知DNA聚合酶具有35外切酶功能校对复制过程中的核苷酸，也就是说聚合酶在开始形成一个新的磷酸二酯键前，总是检查前一个碱基是否正确，这就决定了它不能从头开始合成。因此先合成一条低忠实性的多核苷酸来开始DNA的合成，并以核糖核苷酸来表示是“暂时”的，当DNA开始聚合以后再以53外切酶的功能切除，以高忠实性的脱氧核苷酸取而代之，确保复制的忠实性。第44页/共111页领头链随从链冈崎片段5′3′′5′3拓扑异构酶解链酶单链结合蛋白DNA聚合酶引物酶及引发体DNA连接酶引物课堂小结第45页/共111页三、真核DNA的复制合成真核DNA的合成的基本过程类似于原核DNA，不同之处：

多复制起点至少有五种聚合酶αβγδε

端粒的复制依赖于端粒酶真核生物DNA聚合酶

αβγδε亚基数44425分子量（KD)＞25036-38160-300170256细胞内定位核核线粒体核核5′→3′聚合活性＋＋＋＋＋3′→5′外切活性－－－－－

功能复制、引发修复复制复制复制第46页/共111页第47页/共111页DNA复制过程第48页/共111页真核生物DNA复制叉结构示意图第49页/共111页端粒酶（telomerase）

DNA复制需要引物，但在线形DNA分子末端不可能通过正常的机制在引物被降解后合成相应的片段.如果没有特殊的机制合成末端序列，染色体就会在细胞传代中变得越来越短。这一难题是通过端粒酶的发现才得到了澄清，端粒酶是一种含RNA的蛋白复合物，实质上是一种逆转录酶，它能催化互补于RNA模板的DNA片段的合成，使复制以后的线形DNA分子的末端保持不变。

初步研究表明，人体中生殖细胞的端粒长度保持不变，而体细胞的端粒长度则随个体的老化而逐步缩短。对此的一个推论是：人的生殖细胞具端粒酶的活力，体细胞则否。这一问题的解决无疑会有助于对生命衰老的认识。5´3´AAAACCCCAAAACCCCCCA端粒酶第50页/共111页端粒合成的一种模型3´5´TTTTGGGGTTTTG5´3´AAAACCCCAAAACCCCCCAAA3´5´TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTG5´3´AAAACCCCAAAACCCCCCAAATTGGGTGGGT3´5´AATTTTG5´3´AAAACCCCAAAACCCCCCAGTTTTG整合和杂交移位和再杂交端粒合成的完成TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGTTTT5´3´nAA3´TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGT5´3´TTCCCCTnAA3´TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGT5´3´TTAAAACCCCAAAACCCCAAAACCCCTn进一步加工继续延伸第51页/共111页真核和原核DNA细胞复制比较第52页/共111页四、逆转录1、逆转录：是以RNA为模板合成DNA的过程。2、逆转录酶：是一种以RNA为模板的DNA聚合酶。没有3’5’外切酶的活性，所以没有校对功能，逆转录的错配率高。第53页/共111页五、DNA的损伤修复突变可分为：自发突变、人工诱变突变的意义突变是进化、分化的分子基础只有基因型改变的突变致死性的突变突变是某些疾病的发病基础DNA

的损伤也称突变，是指DNA分子上碱基的改变。第54页/共111页二、引发突变的因素

诱变因素及突变类型第55页/共111页三、突变分子改变的类型错配（点突变）一个碱基改变缺失、插入和框移突变片段插入或缺失重排较大片段重组或重排第56页/共111页四、损伤的修复损伤--复制过程中发生的DNA突变光修复切除修复重组修复SOS修复第57页/共111页

（一）光修复紫外光照射可使相邻的两个T形成二聚体

光修复酶可使二聚体解聚为单体状态，DNA完全恢复正常。光修复酶的激活需300-600μm波长的光。第58页/共111页（二）切除修复参与的酶有核酸内切酶，polⅠ,DNA连接酶第59页/共111页

（三）重组修复重组蛋白RecA，polⅠ，连接酶参与损伤会保留下去第60页/共111页（四）SOS修复DNA损伤面太大，复制难以继续。通过SOS修复，复制有可能继续，细胞有可能存活，但SOS修复机制的特异性低，对碱基的识别、选择能力差、错误多。

第61页/共111页第二节RNA的生物合成单击画面继续定义：RNA的生物合成就是转录，即以DNA为模板，在依赖于DNA的RNA聚合酶的催化下，以4种NTP（ATP、CTP、GTP和UTP为原料，合成RNA的过程。合成部位：细胞核合成原料：四种NTP第62页/共111页转录特点：1、转录单位：启动子终止子2、不对称转录：两条DNA链不同时进行转录的现象。编码链或有意义链；模板链或反意义链3、RNA聚合酶：

全酶：有αα‘ββ’σ5个亚基组成作用识别启动子，引发RNA的合成。

核心酶：不含σ亚基，延长RNA链第63页/共111页(二)转录过程1.起始第64页/共111页第65页/共111页2.延长σ因子循环

第66页/共111页3.终止

不依赖r

-因子的终止子：第67页/共111页依赖r

-因子的终止子的终止反应：

r

-因子：含六聚体的寡聚蛋白，具有依赖RNA的NTP酶活性，它结合于新生RNA上，借助于水解NTP产生能量推动RNA聚合酶向前移动，当酶遭遇终止子时暂停前进，r

-因子追上酶，与酶相互作用释放RNA。还具有RNA-DNA解螺旋酶活性。第68页/共111页转录过程：转录的起始：RNA的延长：5´3´识别解链磷酸二酯键的形成（ATP、GTP）转录的终止：遇到终止子，RNA链停止延长，核心酶脱离，新RNA释放。第69页/共111页第70页/共111页第71页/共111页AG

T

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DNA的一条链AGCUGACGGUUU游离的核糖核苷酸

(原料）DNA解旋，以一条链为模板合成RNA细胞核中单击画面继续第72页/共111页AG

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A

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AGCUGACGGUUU

DNA与RNA的碱基互补配对：A——U；T——A；C——G；G—CRNA聚合酶细胞核中单击画面继续第73页/共111页AG

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AGCGACGGUUUU

组成

RNA的核糖核苷酸一个个连接起来细胞核中单击画面继续第74页/共111页AG

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GCGACGGUUUUA细胞核中单击画面继续第75页/共111页AG

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GCGACGUUGUUA细胞核中单击画面继续第76页/共111页AG

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GCGACGUGUUAA细胞核中单击画面继续第77页/共111页AG

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GCGACGGUUAAU细胞核中单击画面继续第78页/共111页AG

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GCGACGGUUAAUA细胞核中单击画面继续第79页/共111页AG

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GCGCGGUUAAUAU细胞核中单击画面继续第80页/共111页AG

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GGCGGUUAAUAUC细胞核中单击画面继续第81页/共111页AG

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GGCGGUUAAUAUCDNA上的遗传信息就传递到mRNA上mRNADNA细胞核中单击画面继续第82页/共111页AG

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UCAUGAUUAmRNA

细胞质

细胞核

核孔DNAmRNA在细胞核中合成单击画面继续第83页/共111页AG

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UCAUGAUUAmRNA

细胞质

细胞核mRNA通过核孔进入细胞质UCAUGAUUAmRNA单击画面继续第84页/共111页AG

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UCAUGAUUAmRNA

细胞质

细胞核mRNA通过核孔进入细胞质UCAUGAUUAmRNA单击画面继续第85页/共111页DNA和RNA合成的比较第86页/共111页第三节RNA转录后的加工原核生物RNA的加工真核生物RNA的加工第87页/共111页转录后加工：指在细胞内，由RNA聚合酶合成的初始转录产物需要经过一系列的变化才能转变为成熟的RNA分子的过程。第88页/共111页（一）、rRNA前体的加工甲基化6500个核苷酸核酸内切酶RNaseⅢ、P核酸外切酶一、原核生物RNA的加工第89页/共111页（二）tRNA的加工第90页/共111页三、真核生物RNA的一般加工转录初始产物（hnRNA）（一）mRNA前体的加工第91页/共111页真核mRNA前体的加工步骤:（1）hnRNA被剪接，把内含子（DNA上非编码序列）转录序列剪掉，把外显子（DNA上的编码序列）转录序列）拼接上，真核生物一般为不连续基因。加工包括：（4）分子内部的核苷酸甲基化修饰。（3）5’端连接“帽子”结构（m7G5ppp5NmpNp-）；（2）3’端添加polyA“尾巴”；第92页/共111页第93页/共111页真核mRNA的5’－“帽子”加工第94页/共111页多聚腺苷酸聚合酶

真核生物mRNA

3’-“尾巴”的加工内切酶加尾信号第95页/共111页因发现断裂基因而获1993年诺

贝尔生理学奖的RichardJ

RobertandPhllipASharp第96页/共111页（二）真核rRNA前体的加工第97页/共111页（三）真核tRNA前体的加工第98页/共111页四、RNA的拼接机理大多真核生物基因是断裂基因，即含有内含子。断裂基因的转录产物必需通过拼接，去除插入部分（内含子,intron），使编码区（外显子,exon）成为连续序列。这是基因表达的重要环节。内含子的结构多种多样，拼接机制也是多种多样的。RNA的拼接方式类型Ⅰ内含子的自我拼接：核酶的作用类型Ⅱ内含子的自我拼接：核酶的作用hnRNA的拼接：核内小RNA(SnRNA)与蛋白质组成核糖核蛋白体（snRNP）的作用(类型Ⅲ内含子的切除）。核tRNA的拼接：酶促拼接第99页/共111页核酶的发现：

1981年CechT在研究四膜虫(Tetrahymenathermophila)rRNA前体拼接过程中发现，此类的拼接无需蛋白质的酶参与作用，它可自我催化完成。Cech称具有催化功能的RNA为核酶（ribozyme）。1989年cechT和AltmanS共同获诺贝尔化学奖，AltmanS的贡献是发现RnaseP中的M1RNA单独也具有催化功能。核酶的发现改变了酶的化学本质是蛋白质的传统观念，被认为是近二十年来生物化学领域中最令人鼓舞的成就之一。第100页/共111页TheM1RNAinribonucleasePiscatalyticTheintroninthepre-rRNAofTetrahemenaisself-spliced因发现核酶而获诺贝尔奖的两位科学家：第101页/共111页第四节基因工程及分子生物学技术简介

一、基因工程二、体细胞克隆技术三、聚合酶键式反应（polymerasechainreaction,PCR）第102页/共111页一、基因工程简介

基因工程亦称遗传工程，即利用DNA重组技术的方法，把DNA作为组件，在细胞外将一种外源DNA（目的基因）和载体DNA重新组合连接（重组），最后将重组体转入宿主细胞，使外源基因DNA在宿主细胞中，随细胞的繁殖而增殖（cloning，克隆），或最后得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传性状。

基因工程的操作技术

基因工程的应用与前景第103页/共111页基因工程的操作技术

ForeignDNAtobeinser