生物化学002氨基酸与蛋白质

生物化学002氨基酸与蛋白质第1页/共169页2023/4/182蛋白质是由20种L-型α氨基酸组成的长链分子。第一节

蛋白质概论一、

蛋白质的化学组成与分类1、元素组成碳50%

氢7%

氧23%

氮16%

硫0-3%

微量的磷、铁、铜、碘、锌、钼凯氏定氮：粗蛋白质含量=蛋白氮×6.252、氨基酸组成第2页/共169页2023/4/183酶、运输蛋白、营养和贮存蛋白、激素、受体蛋白、运动蛋白、结构蛋白、防御蛋白。3、分类（1）

按组成简单蛋白结合蛋白（2）按分子外形的对称程度球状蛋白质纤维状蛋白质膜蛋白质（3）按功能第3页/共169页2023/4/184蛋白质分子量=氨基酸数目*110二、蛋白质的大小与形状

少于50个氨基酸的低分子量氨基酸多聚物称为肽，寡肽或生物活性肽、多肽。多于50个氨基酸的称为蛋白质。110=氨基酸残基的平均分子量（P160）第4页/共169页2023/4/185四级结构：亚基之间的聚集形式三、蛋白质分子的构象与结构层次蛋白质都有自己特有的天然空间结构，称为构象。一级结构：氨基酸顺序二级结构：α-螺旋、β-折叠、β-转角，无规卷曲三级结构：整个肽链（亚基）的形状第5页/共169页2023/4/1861．酶2．结构成分（结缔组织的胶原蛋白、血管和皮肤的弹性蛋白、膜蛋白）3．贮藏（卵清蛋白、种子蛋白）4．物质运输（血红蛋白、Na+-K+-ATPase、葡萄糖运输载体、脂蛋白、电子传递体）5．细胞运动（肌肉收缩的肌球蛋白、肌动蛋白）6．激素功能（胰岛素）7．自我保护（抗体、皮肤的角蛋白、血凝蛋白8．接受、传递信息（受体蛋白，味觉蛋白）9．调节、控制细胞生长、分化、和遗传信息的表达（组蛋白、阻遏蛋白）四、

蛋白质功能的多样性第6页/共169页2023/4/187第二节

氨基酸

四大类生物分子中，蛋白质是生物功能的主要载体，而氨基酸是蛋白质的构件分子。

自然界中存在的成千上万种蛋白质，在结构和功能上的惊人的多样性归根结底是由20中常见的氨基酸的内在性质造成的。这些性质包括：聚合能力酸碱性侧链结构的多样性化学功能的多样性第7页/共169页2023/4/188一、蛋白质的水解酸水解：色氨酸破坏，天冬酰胺、谷胺酰胺脱酰胺基碱水解：消旋，色氨酸稳定酶水解：水解位点特异，用于一级结构分析，肽谱第8页/共169页2023/4/189非蛋白质氨基酸：存在于生物体内但不组成蛋白质(约150种)二、氨基酸的结构与分类基本氨基酸（编码的蛋白质氨基酸）：组成蛋白质，20种稀有氨基酸：是多肽合成后由基本氨基酸经酶促修饰而来重点第9页/共169页2023/4/1810α-氨基酸的一般结构α-氨基酸

与羧基相邻的α-碳原子（Cα）上有一个氨基的氨基酸。COO--Cα-RH3N可变的侧链H第10页/共169页2023/4/1811（1）R为脂肪烃基的氨基酸（5种）（一）基本氨基酸（编码的蛋白质氨基酸，20种）1、按照R基的化学结构分类第11页/共169页2023/4/1812Gly是唯一不含手性碳原子的氨基酸，因此不具旋光性从Gly至Ile，R基团疏水性增加

特点R基均为中性烷基，R基对分子酸碱性影响很小，它们几乎有相同的等电点。（6.0±0.03）第12页/共169页2023/4/1813（2）R中含有羟基和硫的氨基酸（共4种）第13页/共169页2023/4/1814★Ser的-CH2OH基（pKa=15）在生理条件下不解离，但在大多数酶的活性中心都发现有Ser残基存在。★Ser和Thr的-OH往往与糖链相连，形成糖蛋白。

★Cys的R中含巯基（-SH），具有两个重要性质：（1）在较高pH值条件，巯基离解。（2）两个Cys的巯基氧化生成二硫键，生成胱氨酸。★Met在生物合成中是一种重要的甲基供体。特点第14页/共169页2023/4/1815（3）R中含有酰胺基团（2种）酰胺基中氨基易发生氨基转移反应

第15页/共169页2023/4/1816（4）R中含有酸性基团（2种）Asp、GluAsp侧链羧基pKa为3.86，Glu侧链羧基pKa为4.25它们是唯一在生理条件下带有负电荷的的两个

氨基酸第16页/共169页2023/4/1817（5）R中含碱性基团（3种）第17页/共169页2023/4/1818★Lys侧链氨基的pKa为10.53，生理条件下，Lys侧链带有一个正电荷（—NH3+），侧链的氨基反应活性增大。

★

Arg是碱性最强的氨基酸，侧链上的胍基是已知碱性最强的有机碱，pKa值为12.48，生理条件下完全质子化。

★

His是pKa值最接近生理pH值的一种（游离氨基酸中为6.00，在多肽链中为7.35），是在生理pH条件下唯一具有缓冲能力的氨基酸。★

His在酶的酸碱催化机制中起重要作用特点第18页/共169页2023/4/1819在280nm处，Trp吸收最强，Tyr次之，Phe最弱。（6）芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸）CH2H3N+-C-HCOO-CH2H3N+-C-HCOO-OHNHCHCCH2H3N+-C-HCOO-苯丙氨酸（Phe,F）酪氨酸（Tyr,Y）色氨酸（Trp,W）第19页/共169页2023/4/1820（7）、杂环族氨基酸（2种）Pro的α-亚氨基是环的一部分，因此具有特殊的刚性结构。一般出现在两段α-螺旋之间的转角处，Pro残基所在的位置必然发生骨架方向的变化，第20页/共169页2023/4/1821婴儿期：Arg（精氨酸）和His（组氨酸）供给不足，属半必需氨基酸。u必需氨基酸u成年人：Thr苏氨酸Val缬氨酸

Leu亮氨酸Ile异亮氨酸

Phe苯丙氨酸Trp色氨酸

Lys赖氨酸Met甲硫氨酸携（缬氨酸）一（异亮氨酸）两（亮氨酸）本（苯丙氨酸）单（蛋氨酸，即甲硫氨酸）色（色氨酸）书（苏氨酸）来（赖氨酸）。

携（写）一两本单色书来；一两色素本来淡些；假设来写一两本书第21页/共169页（一）

赖氨酸（Lysine

）：促进大脑发育，是肝及胆的组成成分，能促进脂肪代谢，调节松果腺、乳腺、黄体及卵巢，防止细胞退化；

（二）

色氨酸（Tryptophane）：促进胃液及胰液的产生；

（三）

苯丙氨酸（Phenylalanine）：参与消除肾及膀胱功能的损耗；

（四）

蛋氨酸（又叫甲硫氨酸）（Methionine）；参与组成血红蛋白、组织与血清，有促进脾脏、胰脏及淋巴的功能；

（五）

苏氨酸（Threonine）：有转变某些氨基酸达到平衡的功能；

（六）

异亮氨酸（Isoleucine

）：参与胸腺、脾脏及脑下腺的调节以及代谢；脑下腺属总司令部作用于甲状腺、性腺；

（七）

亮氨酸（Leucine

）：作用平衡异亮氨酸；

（八）

缬氨酸（Viline）：作用于黄体、乳腺及卵巢。

（九）

组氨酸（Hlstidine）：作用于代谢的调节；

2023/4/1822第22页/共169页2023/4/1823

在维持蛋白质的三维结构中起着重要（蛋白质的疏水核心）。（1）非极性氨基酸9种这类氨基酸的侧链都能与水形成氢键，因此很容易溶于水（2）不带电何的极性氨基酸6种（3）带负电荷的氨基酸(酸性氨基酸)2种（4）带正电荷的氨基酸(碱性氨基酸)3种第23页/共169页2023/4/1824非极性氨基酸

在维持蛋白质的三维结构中起着重要作用（蛋白质的疏水核心）。第24页/共169页2023/4/1825第25页/共169页2023/4/1826不带电荷的极性氨基酸这类氨基酸的侧链都能与水形成氢键，因此很容易溶于水。第26页/共169页2023/4/1827带负电荷的氨基酸(酸性氨基酸)第27页/共169页2023/4/1828带正电荷的氨基酸(碱性氨基酸)第28页/共169页2023/4/1829

胶原蛋白中的Lys侧链氧化时能形成很强的分子间(内)交联。Arg的侧链碱性很强，与NaOH相当。His是一个弱碱，是天然的缓冲剂，往往存在于许多酶的活性中心。

非极性氨基酸一般形成蛋白质的疏水核心，带电荷的氨基酸和极性氨基酸位于表面。酶的活性中心：His、Ser、Cys第29页/共169页2023/4/1830（二）

非编码的蛋白质氨基酸也称修饰氨基酸，是在蛋白质合成后，由基本氨基酸修饰而来。（1）4-羟脯氨酸

（2）5-羟赖氨酸

这两种氨基酸主要存在于结缔组织的纤维状蛋白中。

（3）6-N-甲基赖氨酸存在于肌球蛋白中

（4）г-羧基谷氨酸存在于凝血酶原及某些具有结合Ca2+离子功能的蛋白质中。

（5）Tyr的衍生物：3.5-二碘酪氨酸、甲状腺素存在于甲状腺蛋白中（6）锁链素由4个Lys组成存在于弹性蛋白中第30页/共169页2023/4/1831第31页/共169页2023/4/1832β-Ala（泛素的前体）、γ-氨基丁酸（神经递质）（三）

非蛋白质氨基酸不组成蛋白质，但有生理功能的氨基酸L-瓜氨酸、L-鸟氨酸是尿素循环的中间物1、L-型α–氨基酸的衍生物2、D-型氨基酸D-Glu、D-Ala（肽聚糖中）、D-Phe（短杆菌肽S）3、β-、γ-、δ-氨基酸第32页/共169页2023/4/1833第33页/共169页第34页/共169页2023/4/1835精氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸是尿素循环的中间物。三、氨基酸的功能1、组成蛋白质2、一些氨基酸及其衍生物充当化学信号分子-氨基丁酸，色氨酸衍生物：5-羟色胺、褪黑激素，都是神经递质。甲状腺素（Tyr衍生物），吲哚乙酸（Trp衍生物）都是激素3、氨基酸是许多含N分子的前体物核酸的含氮碱基、血红素、叶绿素的合成都需要氨基酸。4、一些基本氨基酸和非基本氨基酸是代谢中间物第35页/共169页2023/4/1836Gly（甘氨酸）只有一种构型,无旋光性Thr（苏氨酸）和Ile（异亮氨酸）有四种光学异构体。其余17种氨基酸有两种光学异构体：L型、D型。构成蛋白质的氨基酸均属L-型。

四、氨基酸的构型、旋光性和光吸收1、

氨基酸的构型第36页/共169页2023/4/1837第37页/共169页2023/4/1838

L-苏氨酸和D-苏氨酸组成消旋物。L-别一苏氨酸和D-别-苏氨酸组成消旋物2、

氨基酸的旋光性★氨基酸的旋光性（符号和大小）取决于它的R基的性质，并与溶液的pH值有关。★外消旋物：D-型和L-型的等摩尔混合物。第38页/共169页2023/4/1839胱氨酸有三种立体异构体：

L-胱氨酸、D-胱氨酸、内消旋胱氨酸。L-胱氨酸和D-胱氨酸是外消旋物★内消旋物：分子内消旋第39页/共169页2023/4/18403、氨基酸的光吸收性Tyr、Phe、Trp的R基含有共轭双键，在220-300nm近紫外区有吸收。p145第40页/共169页2023/4/1841五、

氨基酸的酸碱性质1、氨基酸在晶体和水溶液中主要以兼性离子形式存在2、氨基酸的两性解离和酸碱滴定曲线（1）pKa/就是氨基酸50%解离（[碱]=[酸]）时溶液的pH值，Ka/就是此时溶液的[H+]（2）当HA50%解离时，溶液的pH值等于pKa/（3）pH=pKa/时，[碱]=[酸]（50%解离）

pH>pKa/时，[碱]>[酸]（＞50%解离）

pH<pKa/时，[酸]>[碱]（＜50%解离）第41页/共169页2023/4/1842甘氨酸的滴定曲线（解离曲线）第42页/共169页2023/4/1843起点：100%G+

净电荷：+1第一拐点：

50%G+

，50%G±

平均净电荷：+0.5

pH=pK1+lg[G±]/[G+]=pK1=2.34第二拐点：0%G±

净电荷：0

等电点pI=5.97第三拐点：50%G±

，50%G-

平均净电荷：-0.5

pH=pK2+lg[G-]/[G±]=pK2=9.6终点：

100%G-

净电荷：-1在pH2.34和pH9.60处，Gly具有缓冲能力。第43页/共169页2023/4/1844第44页/共169页2023/4/1845Gly等电点的计算第45页/共169页2023/4/184622)3()3()(RNHNHCOOHpKpKpIpKpKpI+=+=---a2)(RCOOHpKpKpI+=-aaa中性氨基酸碱性氨基酸酸性氨基酸氨基酸等电点的计算第46页/共169页2023/4/1847★pH<pI时，-NH2解离成-NH3+，氨基酸带正电荷，在电场中向负极移动。★pH>pI时，-COOH解离成-COO-，氨基酸带负电荷，在电场作用下向正极移动。★pH=pI时，氨基酸净电荷为零，在电场中不移动第47页/共169页2023/4/1848六、

氨基酸的化学性质+HNO2+N2↑

收集反应放出的氮气，可用来测定氨基酸的含量，这种测定氨基酸含量的方法称为范斯莱克（Vanslyke）氨基测定法。1、与亚硝酸反应（一）α-NH2参加的反应第48页/共169页2023/4/1849

苄氧甲酰氯（carbobenzyloxychloride,Cbz-Cl)

叔丁氧甲酰氯对-甲苯磺酰氯邻苯二甲酸酐2、与酰化试剂反应氨基酸的氨基与酰氯或酸酐在弱碱溶液中发生作用时，氨基即被酰基化。酰化试剂★酰化试剂在多肽的人工合成中被用作氨基保护剂。P136第49页/共169页2023/4/1850（DNS-氨基酸，黄色荧光）★丹磺酰氯（DNS-Cl，5—二甲基氨基萘-1-磺酰氯）常用于多肽链—NH2末端氨基酸的标记和微量氨基酸的定量测定。第50页/共169页2023/4/1851★Sanger

反应

（2，4一二硝基氟苯，DNFB）

DNP-氨基酸被Sanger用来测定多肽的NH2末端氨基酸3、

烃基化反应（弱碱）（黄色）

氨基酸氨基的一个H原子可被烃基（包括环烃及其衍生物）取代。第51页/共169页2023/4/1852苯异硫氰酸酯，PITC

苯氨基硫甲酰衍生物（PTC-多肽）苯乙内酰硫脲衍生物（PTH-氨基酸），无色，可以用层析法分离鉴定。被Edman用来鉴定多肽的NH2末端氨基酸

（弱碱）（CH3NO2/H+）★Edman反应第52页/共169页2023/4/1853甲醛甲醛西佛碱是某些酶促反应的中间产物（如转氨基反应的中间产物）。4、生成西佛碱的反应（Schiff）氨基酸的α-氨基能与醛类化合物反应生成弱碱（Schiff’sbase）第53页/共169页2023/4/18545、脱氨基反应

氨基酸在生物体内经氨基酸氧化酶催化即脱去α-氨基而转变成酮酸。CH3CCOOHO氨基酸氧化酶第54页/共169页2023/4/1855（二）α-羧基参加的反应1、成盐、成酯反应可以屏蔽羧基活化氨基RCHCOOHNH2+C2H5OH干燥，HCl回流RCHCOOC2O5NH3Cl-++H2O成酯反应RCHCOOHNH2+NaOHRCHCOONaNH2+H2O第55页/共169页2023/4/1856

氨基被保护后，羧基可与二氯亚砜或五氯化磷反应，生成酰氯，使羧基活化，在多肽的人工合成中常用。

2、成酰氯的反应HN-保护基R-CH-COOH+PCl5HN-保护基R-CH-COOCl+POCl3+HCl第56页/共169页2023/4/18573、叠氮反应活化羧基，可用于肽的人工合成。YNHOR-CH-C-OCH3酰化氨基酸甲酯（Y=酰基）YNHOR-CH-C-NHNH2酰化氨基酸酰肼NH2NH2YNHOR-CH-C-N-N=N+H2O酰化氨基酸叠氮第57页/共169页2023/4/1858将-氨基酸加热时，可脱去CO2得到胺。Ba(OH)2△尸胺4、脱羧基反应第58页/共169页2023/4/1859

茚三酮在弱酸中与α-氨基酸共热，引起氨基酸的氧化脱氨，脱羧反应，最后，茚三酮与反应产物——氨和还原茚三酮反应，生成紫色物质（λmax=570nm）。（三）α-NH2和α-COOH共同参加的反应1、与茚三酮反应第59页/共169页++NH3CO2RCHOH+

++CCCOHOCCCOON蓝紫色复合物Pro、Hy-Pro与直接形成黄色化合物（λmax=440nm）茚三酮还原茚三酮还原茚三酮茚三酮（λmax=570nm）第60页/共169页2023/4/18612、成肽反应

一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基可以缩合成肽，形成的键称肽键。肽键第61页/共169页2023/4/1862（四）

侧链R基参加的反应

——用于蛋白质的化学修饰略第62页/共169页2023/4/1863（一）基于电荷性质差异的分离方法七、

氨基酸的分离和分析Glu、Leu、His、Lys，4种混合样，在pH6.0时，泳动方向1、电泳分离电泳的基本原理GluLeuHisLyspI3.225.987.599.74+-第63页/共169页2023/4/18642、

离子交换柱层析磺酸型阳离子交换树脂氨基酸与树脂上解离基团之间的静电引力氨基酸与树脂基质聚苯乙烯之间的疏水作用NH3-CH-COOHR+第64页/共169页2023/4/1865第65页/共169页2023/4/1866第66页/共169页2023/4/18671、纸层析流动相：丁醇、醋酸、水★基本步骤：点样、展层、现色、定性（定量）（二）基于分配系数（极性）差异的分离方法

——分配层析分配系数：在流动相中分配系数越大，移动越快。固定相：吸附的水逆流分溶原理第67页/共169页2023/4/18682、薄层层析★基本步骤：铺板、点样、展层、现色、定性（定量）★支持剂：纤维素粉、硅胶、氧化铝粉第68页/共169页2023/4/18693、分配柱层析支持剂：纤维素、淀粉、硅胶固定相：吸附水流动相；苯酚、正丁醇第69页/共169页2023/4/1870固定相：涂有薄层液体的惰性颗粒流动相：H2、N2、CO2★前提：样品能汽化、热稳定（三）气液层析（气相层析、气相色谱）第70页/共169页2023/4/1871分配层析离子交换层析吸附层析凝胶过滤层析（四）高效液相层析（HPLC）第71页/共169页2023/4/1872第三节

蛋白质的一级结构

（共价结构）蛋白质结构层次第72页/共169页2023/4/1873蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序(含二硫键)一级结构（共价结构）二级结构

多肽主链中各个肽段借助于相邻氨基酸之间的氢键形成的构象。主要有α-螺旋、β折叠、β-转角、无规卷曲。超二级结构

由两个以上二级结构单元相互聚集形成的有规则的二级结构的组合体如αα、βαβ、βββ。第73页/共169页2023/4/1874第74页/共169页2023/4/1875第75页/共169页2023/4/1876第76页/共169页2023/4/1877第77页/共169页2023/4/1878

大的球蛋白分子中，多肽链形成几个紧密的球状构象，彼此以松散的肽链相连，此球状构象是结构域，结构域是多肽链的独立折叠单位，一般由100-200个氨基酸残基构成。结构域第78页/共169页2023/4/1879单链蛋白质只有一、二、三级结构，无四级结构。三级结构

整条多肽链或亚基通过盘旋、折叠，形成紧密的、借各种次级键维持的球状构象。四级结构寡聚蛋白中亚基种类、数目、空间排布及亚基间相互作用力。第79页/共169页2023/4/1880第80页/共169页2023/4/1881第81页/共169页2023/4/1882酰胺平面，肽单位间以α-C原子相隔，构成肽链。一、肽和肽键的结构肽

一个氨基酸的羧基和另一个氨基酸的氨基脱水缩合而成的化合物。其中的氨基酸单位称氨基酸残基。肽键氨基酸间脱水后形成的共价键称肽键（酰氨键）。肽单位第82页/共169页2023/4/1883五肽

名称：丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸写法：ＮSer-Gly--Try-AlaLeu或ＳＧＹＡＬ，第83页/共169页2023/4/1884肽键具有部分双键性质，不能自由旋转。肽键具有平面性，组成肽键的4个原子和2个Cα几乎处在同一平面内（酰氨平面）。肽键亚氨基在pH014内不解离。★肽键的结构特点第84页/共169页2023/4/1885★多肽链可以看成由Cα串联起来的无数个酰胺平面组成第85页/共169页2023/4/1886

短肽在晶体和水溶液中也是以偶极离子形式存在。

肽的酸碱性质主要取决于Ｎ端α－ＮＨ２和Ｃ端α－COOH以及侧链Ｒ上可解离的基团。在长肽或蛋白质中，可解离的基团主要是侧链基团。二、肽的重要性质1、旋光性一般短肽的旋光度等于其各个氨基酸的旋光度的总和。2、肽的酸碱性质第86页/共169页2023/4/1887双缩脲反应是肽和蛋白质特有的反应，游离氨基酸无此反应。3、肽的化学反应

肽的α-羧基，α-氨基和侧链R基上的活性基团都能发生与游离氨基酸相似的反应。★双缩脲反应

凡是有肽键结构的化合物都会发生双缩脲反应，可用于定量分析。H2N-CO-NH-CO-NH2双缩脲CuSO4-NaOH紫红色化合物第87页/共169页2023/4/1888★红细胞中的巯基缓冲剂。☆参与氧化还原过程，清除内源性过氧化物和自由基，维护蛋白质活性中心的巯基处于还原状态。

三、天然存在的活性肽1、谷胱甘肽Glu—Cys—Gly第88页/共169页2023/4/1889

由短杆菌产生的10肽环。抗革兰氏阳性细菌，临床用于治疗化浓性病症。

2、

短杆菌肽（抗生素）第89页/共169页2023/4/1890①合成蛋白质的剪切、修饰②酶专一性逐步合成（如谷胱甘肽）、③动物肠道可吸收寡肽3、

脑啡肽（5肽）

Met脑啡肽：

Tyr—Gly—Gly—Phe—Met

Leu脑啡肽：

Tyr—Gly—Gly—Phe—Leu

具有镇痛作用。生物体内寡肽的来源第90页/共169页2023/4/18914、肽类激素第91页/共169页2023/4/1892四、蛋白质一级结构测定（一）蛋白质测序的基本策略

对于一个纯蛋白质，理想方法是从N端直接测至C端，但目前只能测60个N端氨基酸。1、直接法（测蛋白质的序列）2、间接法（测核酸序列推断氨基酸序列）第92页/共169页2023/4/1893（1）

测定蛋白质分子中多肽链的数目（2）

拆分蛋白质分子中的多肽链。（3）

断裂链内二硫键。（4）分析多肽链的N末端和C末端。（5）

测定多肽链的氨基酸组成。（6）

多肽链部分裂解成肽段。（7）

测定各个肽段的氨基酸顺序（8）

确定肽段在多肽链中的顺序。（9）

确定多肽链中二硫键的位置。（二）蛋白质测序的一般步骤第93页/共169页2023/4/1894估算氨基酸残基数，确定肽链数 方法：SDS

凝胶过滤法沉降系数法（三）测序前的准备工作1、

蛋白质的纯度鉴定要求：纯度97%以上，均一。鉴定方法：

⑴聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)要求一条带。

⑵DNS—Cl（二甲氨基萘磺酰氯）法测N端氨基酸。2、测定蛋白质的分子量第94页/共169页2023/4/1895酸水解的同时辅以碱水解。确定肽链中各种氨基酸出现的频率,便于选择裂解方法及试剂。3、

确定亚基种类及数目根据分子量和N末端数4、拆分多肽链，分别分离纯化⑴非共价键结合：

8mol/L尿素，SDS⑵二硫键结合：过甲酸氧化：—S—S—+HCOOOH→SO3Hβ巯基乙醇还原5、

测定氨基酸组成第95页/共169页2023/4/18966、端基分析N端分析★DNS-Cl法最常用，黄色荧光，灵敏度极高，DNS-多肽水解后的DNS-氨基酸不需要提取。★DNFB法Sanger试剂，DNP-多肽，酸水解，黄色DNP-氨基酸，有机溶剂（乙酸乙酯）抽提分离，纸层析、薄层层析、液相等★PITC法Edman法，逐步切下。无色PTH-氨基酸，有机溶剂抽提，层析第96页/共169页2023/4/1897无水肼NH2NH2100℃5-10h。苯甲醛沉淀氨基酸的酰肼，C端游离氨基酸留在上清中。Gln、Asn、Cys、Arg不能用此法。C端分析★肼解法第97页/共169页2023/4/1898羧肽酶A：除Pro、Arg、Lys外的所有C端氨基酸羧肽酶B：只水解Arg、Lys羧肽酶法测C末端★羧肽酶法（Pro不能测）第98页/共169页2023/4/1899①溴化氰

—Met—X—

产率85%②亚碘酰基苯甲酸

—Trp—X—

产率70-100%

③NTCB（2-硝基-5-硫氰苯甲酸）

—X—Cys—④羟胺NH2OH

—Asn—Gly—

约150个氨基酸出现一次（四）肽链的部分裂解和肽段的分离纯化1、化学裂解法第99页/共169页2023/4/18100胰蛋白酶

Lys——X(X≠Pro)Arg——X

胰凝乳蛋白酶

Tyr——X(X≠Pro)Trp——X

Phe——X胃蛋白酶

Phe(Trp、Try、Leu)——Phe(Trp、Try、Leu)Glu蛋白酶

Glu——X（Vs蛋白酶）Arg蛋白酶

Arg——XLys蛋白酶

X——LysPro蛋白酶

Pro——X2、酶法裂解第100页/共169页2023/4/18101①电泳法ＳＤＳ－ＰＡＧＥ根据分子量大小分离②离子交换层析法（DEAE—Cellulose、DEAE—Sephadex）根据肽段的电荷特性分离③反相ＨＰＬＣ法根据肽段的极性分离凝胶过滤根据肽段的大小分离3、肽段的分离纯化要求：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ单带ＨＰＬＣ单峰Ｎ端单一（常用ＤＮＳ－Cl法）第101页/共169页2023/4/18102（1）耦联PITC＋H２N—A-B-C-DpH8—9，40℃PTC——A-B-C-D（2）裂解无水三氟乙酸（TFA）

ATZ—A+H2N—B-C-D（3）转化PTH—A

PTC肽：苯氨基硫甲酰肽ATZ：噻唑啉酮苯胺（一氨基酸）PTH：苯乙内酰硫脲（一氨基酸）

（五）肽段序列测定及肽链的拼接1、Edman法第102页/共169页2023/4/18103荧光基-团或有色试剂标记的PITC试剂。4-N、N-二甲基氨基偶氮苯-4’异硫氰酸酯。2、DNS-Edman法用DNS法测N末端，用Edman法提供（n-1）肽段。3、有色Edman法第103页/共169页2023/4/18104仪器原理：Edman法。1967液相测序仪自旋反应器，适于大肽段。1971固相测序仪表面接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦连肽段的Ｃ端。1981气相测序仪用Polybrene反应器。（聚阳离子）四级铵盐聚合物液相：5nmol20-40肽97%

气相：5pmol60肽98%4、用自动序列分析仪测序第104页/共169页2023/4/1810516肽，Ｎ端HＣ端ＳＡ法裂解：ONSPSEOVERLAHOWT

Ｂ法裂解：SEOWTONVERLAPSHO重叠法确定序列：HOWTONSEOVERLAPS5、肽段拼接成肽链第105页/共169页2023/4/18106第106页/共169页2023/4/18107第107页/共169页2023/4/18108①碘乙酰胺封闭-SH②胃蛋白酶酶解蛋白质③第一向电泳④过甲酸氧化—S—S—生成-SO3H⑤第二向电泳⑥分离出含二硫键的两条短肽，测序⑦与拼接出的肽链比较，定出二硫键的位置。（六）二硫键、酰胺及其他修饰基团的确定1、二硫键的确定（对角线电泳法）方法第108页/共169页2023/4/18109★Asp–Asn、Glu-Gln

酶解肽链，产生含单个Asx或Glx的肽，用电泳法确定是Asp还是Asn★Leu-Glx-Pro-Val肽

在pH=6.0时，电荷量是Leu+Pro0Val-

此肽除Glx外，净电荷为0，可根据此肽的电泳行为确定是Glu或是Gln。2、酰胺的确定举例第109页/共169页2023/4/18110Lys(Arg)-Ser-Asn-Ser(PO4)Arg-Thr-Leu-Ser(PO4)Lys(Arg)–Ala-Ser(PO4)3、糖、脂、磷酸基位置的确定糖类通过Asn、Ser与蛋白质连接，-N-糖苷-0-糖苷脂类Ser、Thr、Cys磷酸Ser、Thr、His经验性序列第110页/共169页2023/4/18111★牛胰RNase变性一复性实验五、蛋白质的一级结构与生物功能（一）蛋白质的一级结构决定高级结构和功能

用(8M尿素+β硫基乙醇)变性、失活透析后构象恢复，活性恢复95%以上。牛胰RNase共有124个氨基酸残基

4个链内二硫键。

分子量：12600p181第111页/共169页2023/4/18112第112页/共169页2023/4/18113血红蛋白在不同的脊椎动物中都具有输送氧气的功能细胞色素在所有的生物中都是电子传递链的组分。（二）同源蛋白质一级结构的种属差异与生物进化同源蛋白质在不同的生物体内行使相同或相似功能的蛋白质。例第113页/共169页2023/4/18114①同源蛋白质的氨基酸序列具有明显的相似性（序列同源性）②有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，称不变残基，不变残基高度保守，是必需的。除不变残基以外，其它位置的氨基酸对不同的种属有很大变化，称可变残基，可变残基中，个别氨基酸的变化不影响蛋白质的功能。③多肽链长度相同或相近同源蛋白质的特点第114页/共169页2023/4/18115亲源关系越远，同源蛋白的氨基酸顺序差异就越大。

通过比较同源蛋白质的氨基酸序列的差异可以研究不同物种间的亲源关系和进化。第115页/共169页2023/4/18116分子量：12,500左右氨基酸残基：100个左右，单链。25种生物中，细胞色素C的不变残基35个。60种生物中，细胞色素C的不变残基27个。亲源关系越近的，其细胞色素C的差异越小。亲源关系越远的，其细胞色素C的差异越大。人与黑猩猩0人与猴1人与狗10人与酵母441、细胞色素C第116页/共169页2023/4/18117●有24个氨基酸残基位置始终不变：A．B链上6个Cys不变，其余18个氨基酸多数为非极性侧链，对稳定蛋白质的空间结构起重要作用。●其它可变氨基酸对稳定蛋白质的空间结构作用不大，但对免疫反应起作用。●猪与人接近，而狗则与人不同，因此可用猪的胰岛素治疗人的糖尿病。2、胰岛素第117页/共169页2023/4/18118第118页/共169页2023/4/18119

镰刀形红细胞贫血现是由于血红蛋白发生了遗传突变引起的链第6位的aa线基由正常的Glu变成了疏水性的Val。

正常人血红蛋白β.NGlu6镰刀型贫血β.NVal6生理条件下电荷：Glu-Va10

亲水疏水（三）蛋白质一级结构的突变分子病分子病基因突变引起的某个功能蛋白的某一个或几个氨基酸残基发生了遗传性替代从而导致整个分子的三维结构发生改变，功能部分或全部丧失。例第119页/共169页2023/4/18120第120页/共169页2023/4/18121第121页/共169页2023/4/18122（四）一级结构的部分切除与蛋白质的激活1、

血液凝固的机理凝血因子（凝血酶原致活因子）凝血酶原凝血酶血纤维蛋白原血纤维蛋白血纤维蛋白凝块第122页/共169页2023/4/18123（1）凝血酶原在凝血酶原致活因子催化下，凝血酶原分子中的Arg274—Thr275、Arg323—Ile324断裂，产生活性凝血酶。

A链49氨基酸

B链259氨基酸第123页/共169页2023/4/18124（2）血纤维蛋白原

从二条α链和二条β链的N端各断裂一个特定的肽键-Arg—Gly-，释放出二个纤维肽A（19个氨基酸）和二个纤维肽B（21个氨基酸），它们含有较多的酸性氨基酸残基。第124页/共169页2023/4/18125A、B肽切除后，减少了蛋白质分子的负电荷，促进分子间聚集，形成网状结构。

在凝血因子XIIIa（纤维蛋白稳定因子）催化下，纤维蛋白质单体间形成共价健（Gln-Lys结合），生成交联的纤维蛋白。第125页/共169页2023/4/181262、胰岛素原的激活前胰岛素原（含信号肽）胰岛素原活性胰岛素（在内质网上信号肽被信号肽酶切除）（在高尔基体上切除C肽）第126页/共169页2023/4/18127胰岛素原活性胰岛素第127页/共169页2023/4/18128第128页/共169页2023/4/18129从理论上讲，一个多肽主链能有无限多种构象。但是，只有一种或很少几种天然构象，且相当稳定。因为：天然蛋白质主链上的单键并不能自由旋转。第四节蛋白质的二级结构和纤维状蛋白质一、多肽主链折叠的空间限制第129页/共169页2023/4/181301、

肽链的二面角

★环绕Cα—N键旋转的角度为Φ环绕Cα—C键旋转的角度称Ψ★只有α碳原子连接的两个键（Cα—N和Cα-C）是单键，能自由旋转。第130页/共169页2023/4/18131★从Cα沿键轴方向看，顺时针旋转的Φ(Ψ)角为正值，反之为负值。★当Φ(Ψ)旋转键两侧的主链呈顺式时，规定Φ(Ψ)=0°第131页/共169页2023/4/18132Φ和Ψ同时为0的构象实际不存在二面角（Φ、Ψ）所决定的构象能否存在，主要取决于两个相邻肽单位中非键合原子间的接近有无阻碍。Cα上的R基的大小与带电性影响Φ和Ψ2、拉氏构象图：可允许的Φ和Ψ值拉氏构象图Ramachandran根据蛋白质中非键合原子间的最小接触距离，确定了哪些成对二面角（Φ、Ψ）所规定的两个相邻肽单位的构象是允许的，哪些是不允许的，并且以Φ为横坐标，以Ψ为纵坐标，在坐标图上标出，该坐标图称拉氏构象图。p206第132页/共169页2023/4/18133第133页/共169页2023/4/18134⑴实线封闭区域一般允许区，非键合原子间的距离大于一般允许距离，此区域内任何二面角确定的构象都是允许的，且构象稳定。⑵虚线封闭区域是最大允许区，非键合原子间的距离介于最小允许距离和一般允许距离之间，立体化学允许，但构象不够稳定。⑶虚线外区域是不允许区，该区域内任何二面角确定的肽链构象，都是不允许的，此构象中非键合原子间距离小于最小允许距离，斥力大，构象极不稳定。对非Gly氨基酸残基，一般允许区占全平面的7.7%，最大允许区占全平面20.3％第134页/共169页2023/4/18135第135页/共169页2023/4/18136Thecrystalstructureofpyruvatekinase第136页/共169页2023/4/18137★多肽主链按右手或左手方向盘绕，形成右手螺旋或左手螺旋，★相邻的螺圈之间形成链内氢键★构成螺旋的每个Cα都取相同的二面角Φ、Ψ。二、

二级结构的基本类型1、α螺旋α螺旋的一般特征第137页/共169页2023/4/18138第138页/共169页2023/4/18139第139页/共169页2023/4/18140第140页/共169页2023/4/18141①二面角：Φ=-57°,Ψ=-48°，是一种右手螺旋②每圈螺旋：3.6个a.a残基，高度：0.54nm③每个残基绕轴旋转100°，沿轴上升0.15nm④氨基酸残基侧链向外⑤相邻螺圈之间形成链内氢链，氢键的取向几乎与中心轴平行。⑥肽键上C=O氧与它后面（C端）第四个残基上的N-H氢间形成氢键。典型的α螺旋有如下特征第141页/共169页2023/4/18142①多肽链上连续出现带同种电荷基团的氨基酸残基,(如Lys，或Asp，或Glu)，不能形成稳定的α—螺旋。如多聚Lys、多聚Glu。②Gly在肽中连续存在时，不易形成α—螺旋。③R基大（如Ile）不易形成α—螺旋④Pro、脯氨酸中止α—螺旋。⑤R基较小，且不带电荷的氨基酸利于α—螺旋的形成。如多聚丙氨酸在pH7的水溶液中自发卷曲成α—螺旋。R侧链对α—螺旋的影响第142页/共169页2023/4/18143pH对α—螺旋的影响第143页/共169页2023/4/18144右手螺旋比左手螺旋稳定。

蛋白质中的α—螺旋几乎都是右手，但在嗜热菌蛋白酶中有很短的一段左手α—螺旋。右手α-螺旋与左手α-螺旋第144页/共169页2023/4/18145α-螺旋结构是一种不对称的分子结构：★α碳原子的不对称性，★构象本身的不对称性。天然α—螺旋能引起偏振光右旋α-螺旋的比旋不等于构成其本身的氨基酸比旋的加和，而无规卷曲的肽链比旋则等于所有氨基酸比旋的加和。α-螺旋结构的旋光性第145页/共169页2023/4/18146平行式：所有参与β-折叠的肽链的N端在同一方向。反平行式：肽链的极性一顺一倒，N端间隔相同反平β-折叠比平行的更