生化系统有效性资料

生化系统有效性资料第1页/共192页用于体外诊断的生物化学标志物分类蛋白质总蛋白白蛋白特种蛋白肿瘤标志物HbA1c多肽胰岛素BNP/NT-proBNPcTn有机小分子和无机离子血脂葡萄糖尿素肌酐尿酸甾体激素离子酶血清：ALTASTALPGGTLDHCKPchEAmylase

尿：NAG

胸腹水：ADA治疗药物均相酶免疫法第2页/共192页技术规范管理到位质量达标第3页/共192页

传统的临床检验，包括生化检验多是手工劳动。要求技术人员:

技能娴熟的，操作专注，劳动强度大，工作效率低，操作结果存在明显的个人差异,

可比性和质量受到影响。不适应临床医学的发展。

第4页/共192页自动检测起源于二十世纪的80年代，西方发达国家和日本电子学光学机器人全自动自动化的进程

计算机和网络技术生物技术酶和蛋白质纯化抗体制备，特别是单克隆抗体的制备加速了第5页/共192页我国

80年代：引进自动生化分析仪，

90年代：引进自动免疫分析仪全自动血球计数仪尿液自动分析仪微生物培养与鉴定新千年：自主研发出自动生化分析仪血球计数仪自动化遍及到医学检验的所有领域如核酸的提取酶联免疫自动加样流水线

第6页/共192页根据自动程度生化分析仪半自动生化分析仪全自动生化分析仪

第7页/共192页第一部分半自动生化分析第8页/共192页（一）主要技术指标分析过程中的部分操作：加样加试剂手工完成混匀吸入

比色孵育自动完成结果计算

半自动生化分析仪第9页/共192页

特点体积小结构简单操作方便普通检查（特种蛋白检测有困难）适合诊所

第10页/共192页第11页/共192页吸样废液蠕动泵

比色：石英卤素灯；0.001Abs

比例泵Peltier控温第12页/共192页反应液（吸液量）：500μl左右微量流动比色池：数十微升恒温器在数秒内使反应平衡到要求的温度温度波动应：小于0.1℃结果：由显示窗显示打印通过接口将数据输出第13页/共192页测定方法：动力学两点法终点法检测编排项目：

30-100第14页/共192页（二）使用注意事项

1.仪器稳定：电压，温度，湿度

2.规定的清洗液清洗管道实验间隔，管道用一般情况：去离子水清洗碱性液清洗去离子水清洗特殊情况：去离子水清洗酸性液清洗去离子水清洗

第15页/共192页3.*基于一级反应的动力学法测定项目要严格掌握启动反应即刻和吸样并开始记录吸光度的时间第16页/共192页*基于零级反应的动力学法测定项目（酶催化活性浓度）控制启动反应和吸样并开始记录吸光度的时间不能擅自缩短延迟时间第17页/共192页*终点法测定注意到：显色产物放置时间对测定具有影响第18页/共192页*动力学测定法代谢物连续监测法酶活力浓度注意到：在测定的延迟期内底物消耗第19页/共192页

温度控制

光源

比色杯

检测器

数据处理

打印输出

定量注加系统

样本

试剂取样、加试剂、混合、孵育反应、检测、结果计算、清洗由仪器自动完成

二、全自动生化分析仪

第20页/共192页连续流动式（管道式）离心式分立式干式

第21页/共192页分立式生化分析仪仪器机械手向分立的比色皿中自动定量注加样本和试剂，一定温度下孵育反应分别进行比色测定。

“顺序分析”

第22页/共192页

离心式自动生化分析仪结构特点:

化学反应器装在离心机的转子位置上仪器机械臂自动将样品和试剂分别置于转头中的样品槽和试剂槽中。离心机开动后圆盘内的样品和试剂受离心力的作用流入盘外比色槽中，混合发生反应，通过比色计进行检测。第23页/共192页分析特点:基于“同步分析”的原理而设计不是随机任选式,按项目顺序分析比色杯必须人工清洗水平测光和垂直测光两种方式

A=ECLA=EC(TV/S)

第24页/共192页干化学生化分析仪反应在固相载体上，测定的是折射光检测系统进行检测的一类仪器分为全自动、半自动生化分析仪检测项目：普通临床生物化学检验药物检测蛋白测定

第25页/共192页第二部分自动生化分析第二部分自动生化分析仪主要结构1.样品装载装置样品盘弧样品架直

第26页/共192页2.输送装置--传送带靠步进马达驱动将试管架依次前移再单架逐管横移至固定位置样品分配臂采样第27页/共192页3.取样单元组成：取样针取样臂取样注射器前进马达第28页/共192页采样针结构特点：针的前端有液面传感器防止空吸或深入采血管下层的凝血块

第29页/共192页采样单元的故障高主要原因

血样表面有气泡未完全凝固就进行测定极易导致加样针阻塞此样本的测定值也假性降低；加样针偏离正确位置应经常注意观察样品杯或样品管口径小样品管过细取样针扎偏：破坏采样装置第30页/共192页4.注加试剂单元组成：试剂针试剂瓶和试剂仓试剂臂取试剂注射器前进马达构第31页/共192页试剂取样针前端有液面传感器：防止空吸或针尖深入试剂盒底部引起试剂针外壁液体挂淋。双试剂有第一试剂和第二试剂取样单元。很多试剂内具有表面活性物质，操作不当，如震荡试剂瓶，或加试剂的速度过快，试剂表面会有气泡，此时试剂取样针前端的液面传感器也会误以为取到样品，致使测定结果的偏差。第32页/共192页试剂瓶形状及大小规格不同应根据工作量考虑试剂规格残留试剂反复使用会影响结果的准确性要考虑试剂开盖后在使用过程中的稳定性不要在运行中添加、更换试剂封闭系统使用的试剂具有条形码仪器设有条形码检查系统，对试剂的种类、批号、规格、有效期等资料，进行核对校验第33页/共192页*注意事项：加样臂和试剂臂的活动区不可放置任何物品仪器在运行过程中不可用手调整任何部件，以免发生穿刺伤样品和试剂的定量注加系统需要定期校正第34页/共192页5.反应单元组成：反应盘

混合装置

温控装置

第35页/共192页反应盘多为转盘式按固定程序转动反应和检测同在比色杯中进行比色杯：石英玻璃无紫外光吸收的塑料第36页/共192页混合装置搅拌棒搅拌棒具特氟隆不沾涂层超声波第37页/共192页6.孵育反应温控装置孵育温度的调控和恒定由计算机控制理想的孵育温度波动应小于±0.1℃

应该定期检测（水浴装置的控温性能可自行检测，采用国家计量院校准的温度计测定水温）第38页/共192页保持恒温的方式有三种①空气浴恒温：在比色杯与加热器之间隔有空气。空气浴恒温的特点是方便、速度快、不需要特殊材料，但稳定性和均匀性与各厂家的设计有关。第39页/共192页②水浴循环恒温式在比色杯周围充盈有水，加热器控制水的温度。水浴恒热的特点是温度恒定，但需特殊的防腐剂以保证水质的洁净，且要定期更换循环水。第40页/共192页③恒温液循环间接加热式比色杯周围流动着一种特殊的恒温液（具无味、无污染、惰性、不蒸发等特点）。比色杯和恒温液之间有极小的空气狭缝，恒温液通过加热狭缝的空气达到恒温。与水浴式循环式相比不需要特殊保养。第41页/共192页7.清洗系统探针和搅拌棒采用激流式或瀑布式等方式自动冲洗。第42页/共192页比色杯清洗装置吸液针吐液针擦拭刷

吸去杯壁上挂淋的水，刷体内部有负压抽吸装置注意擦拭刷是否磨损第43页/共192页样本针试剂针

搅拌棒比色杯清洗机构（清洗针、清洗液、水）第44页/共192页清洗工作流程吸出反应液（吸干）注入洗液（吸干）

碱性液冲洗酸性液冲洗去离子水冲洗三遍擦干第45页/共192页应用生化分析仪的重要注意事项：启用前：正确安装、调试检测方法学的验证携带和交叉污染试验及纠正启用后：正确使用、维护和保养质量控制第46页/共192页携带污染

交叉污染第47页/共192页携带（交叉）污染

测试项目A试剂残留（试剂针、搅拌棒、比色杯）

干扰下一个测试B第48页/共192页样本1(高浓度)项目样本针(携带)污染干扰样本2测定第49页/共192页引发交叉污染的原因共有化

(试剂/样本针/搅拌)处理能力提高(牺牲冲洗的强度和时间为代价)使用/维护不当污垢积聚冲洗力低下(仪器/配件老化/欠维护)测定次序不当冲洗方式安排不当试剂组成第50页/共192页样本携带交叉污染查明及避免（样本针）样本：高值血清，1000倍稀释血清，生理盐水方法：按顺序（1～29号）分析某一项目，如LDH。平均值A平均值B交叉污染率（%）=×100＜0.3%正常AB×10002135791164212224262818314681115171020232527121929第51页/共192页避免样本携带污染方法：

样本针的檫拭给出分析项目名称/指定特殊清洗液第52页/共192页试剂携带交叉污染

Amylase试剂钙

ALP试剂镁镁试剂铁含磷酸盐的缓冲液磷胆固醇试剂胆汁酸基于Trinder反应基于Trinder反应

高含量测定项目(Glu)高含量测定项目(Ua)

第53页/共192页

试剂厂家应提供特定仪器,一定试剂排序后,测定交叉污染;

实验室的试剂排位与试剂厂家推荐的不同,或试剂生产企业未能够提供试剂交叉污染试验结果,应该自己,或请有经验的技术支持做交叉污染试验;第54页/共192页

避免试剂交叉污染的方法调整通道（加样）顺序设置避免交叉污染程序,

选择相关项目→指定清洗液将有交叉污染的项目,放在不同仪器上选择试剂间交叉污染少的测定试剂第55页/共192页比色杯污染的查明及避免杯空白升高，杯间差变大第56页/共192页残留成分对下一分析的影响第1循环全部项目第2、3、4、5循环受干扰项目较大的偶然误差,一般是由于残留成分的影响第57页/共192页比色杯交叉污染避免方法：常规操作中的清洗特殊清洗从试剂选择上考虑常规清洗程序工作正常第58页/共192页8．比色系统(1)光源卤素灯,波长:325～800nm氙灯,波长:285～750nm寿命长发光强度不够时，仪器会自动报警，应及时更换

第59页/共192页（2）比色杯比色杯也是反应杯光径0.5-0.7cm

材料：石英、硬质玻璃或优质塑料要定期检查清洗及时更换不合格的比色杯第60页/共192页（3）单色器

各类自动生化分析仪应用的是可见-紫外吸收光谱法，即监测200～700nm光区某特定波长下发色基团吸光度的变化，辅以微机软件系统的计算来完成测定第61页/共192页

可见-紫外吸收光谱定量的基础是Lamber-Beer定律。该定律说明的是一定浓度范围内吸光物质对单色光吸收的强弱与该物质的浓度之间的关系

A=-lgT=ECL第62页/共192页

传统的分光光度测定：前分光在光源灯和样品杯之间先要用滤光片、棱镜或光栅分光，通过可调的狭缝，取得与样品“互补”的单色光之后，照射到样品杯，再用光电池或光电管作为检测器，测定样量对单色光的吸收量第63页/共192页第64页/共192页

现代大多生化分析仪采用：后分光测量技术将一束白光（混合光）先照到样品杯，然后再用光栅分光，同时用一列发光二极管排在光栅后面作为检测器。后分光的优点：是不需移动仪器比色系统中的任何部件，可同时选用双波长进行测定，这样可降低比色的噪声，提高分析的精确度。第65页/共192页第66页/共192页单色器（分光装置）：滤光片光栅第67页/共192页光栅全息反射式玻璃上覆盖一层金属膜后制成，有一定程度的相差，易被腐蚀蚀刻式凹面所选波长固定地刻制在凹面玻璃上，耐磨损、抗腐蚀、无相差第68页/共192页9.样本条形码识读系统

样本的唯一标识清楚记录样本采集时间记录样本接收时间减少劳动强度自动化的要求依赖HIS的建设（医生工作站）第69页/共192页醫院主機急診看診門診看診

準備採血試管下醫囑令檢體處理

分派處急診掛號處門診掛號處分派工作令回傳檢驗報告值下醫囑令批價收費上傳檢驗報告值

LISSERVER

&DATABASE下載醫囑令下醫囑令批價收費病房看診查詢檢驗報告查詢檢驗報告查詢檢驗報告急診採血

準備採血試管中央採血室(採血)病房採血準備採血試管送病房信息流程第70页/共192页条形码识读系统：扫描系统信号整形译码器

第71页/共192页

以光源扫射黑条/白空相间的条码符号（一维条码）由于黑条/白空对光的反射不同不同宽窄的条符反射光持续时间不同产生强度不同的反射光经光电转换元件接收并转换成相应强度的电信号最后通过信号整形，由译码器翻译用于手工粘贴的普通条码第72页/共192页贴完条码的试管All-in-one的概念第73页/共192页条形码格式与参数初步规划：大小

直/横式参数内容：姓名

病历号码

性别

年龄申请科别

病房

优先

**申请单号

样本种类

抽血量日期时间

注意事项

检验组别管别索引

抗凝剂

保存期限第74页/共192页条形码提供的信息第75页/共192页第76页/共192页临床实验室工作流程与自动化第77页/共192页CentrifugeDecappingAliquottingReceptionlabelingSamplesorting生物化学免疫学免疫学第78页/共192页物理连接多个分析仪的系统第1代朴素功能最大集成化的、模块组合方式的连接系统（分析仪是一个模块）第2代发展第79页/共192页生化分析模块组第80页/共192页物理连接多个分析仪的系统第1代前处理功能最大集成化的、模块组合方式的、物理连接系统（分析仪是一个模块）第2代模块组合方式＋非在线分析仪方式第3代第81页/共192页第三部分全自动生化分析仪安装准备1.自动生化分析仪工作环境的要求仪器工作空间实验室面积足够大，以保证仪器的操作、保养、维修的方便及各种配套设施（如纯水机、UPS不间断电源）电脑控制设备的安置。

第82页/共192页仪器工作条件没有阳光直接照射灰尘非常少平坦没有震动地板承重为仪器重量的130%-140%接地电压波动±10%避免：化学腐蚀物品灰尘电磁辐射

第83页/共192页温度和湿度温度应控制在18～30℃，工作时波动小于±2℃，部分仪器内设置了允许温度范围，当温度超过允许范围时仪器自动停止检测。湿度有严格要求，湿度过高可能引起仪器部件的生锈发霉等情况降低使用寿命或仪器不工作，过于干燥则可能引起静电增加，灰尘吸附增加而干扰光路系统的稳定性。第84页/共192页电源的要求应根据仪器对电源的要求和总负载量设计专用电路要求始终连接符合要求的地线并连接UPS不间断电源（最好延时30分钟以上）。不正常状态（如停电等）下的关机有可能降低仪器的使用寿命和测定数据的丢失。第85页/共192页2.自动生化分析仪的用水及处理临床检验中必须使用纯水配置试剂和淋洗容器，完善的纯水或精制水的来源才能获得良好的实验结果。第86页/共192页第87页/共192页１．蒸馏水蒸馏法是最早使用的纯化水的方法，也是普遍使用的方法,但不是纯化水的理想方法。这是因为用大蒸馏器制成的蒸馏水重金属、无机物、悬浮物和微生物的污染较多，CO2不能去除。蒸馏水的物理化学检查见中国药典二部。第88页/共192页２．去离子水

原水通过阳离子交换柱时，原水中阳离子与柱中阴离子基团结合，氢离子被置换出来，当经阳离子树脂处理过的水流过阴离子交换柱时，水中阴离子滞留在柱中，柱中氢氧根被置换出来，后者与H＋反应生成水。

RH+M+→RM+H＋

（阳离子交换柱）

ROH+X－→RX+OH－

（阴离子交换柱）

H++OH－→H2O第89页/共192页离子交换树脂具一定寿命，使用期限与水中所含杂质量有关。经过阴阳离子交换树脂后的水应不含任何离子，电阻可达18MΩ/CM(25℃)，柱效高，电阻也大。随着使用时间的延长，纯化水的电阻减少，当下降到一定范围（生化用水应＞0.5MΩ/CM），应更换离子交换柱。第90页/共192页目前多用混合式离子交换树脂柱来纯化水，即在柱内装有阳离子和阴离子交换树脂的混合物。水通过混合床时逐步自动去除阴、阳离子。离子交换树脂不能去除水中非电离状态的有机物，悬浮颗粒和微生物。离子交换树脂纯化水的方法不应单独应用，而应放在经蒸馏或反渗透装备后面处理经其初步纯化过的水，以延长交换柱的寿命。第91页/共192页３．反渗透水反渗透是用加压的方法使水渗透过极微小的渗透膜反渗透膜的孔径约为0.001μm，较细菌（0.4～1μm），病毒(0.02～0.4μm)要小可过滤95%以上的溶解和非溶解的无机物、重金属、细菌、病毒颗粒；装置多放在离子交换柱前，为后者提供初级纯水。第92页/共192页4.纯水系统----超纯水的制备国产纯水系统可替代国外产品第93页/共192页纯水系统基本组成：聚酯纤维过滤柱5μm活性碳过滤匣去除有机物反渗透器多级混合离子交换床悬浮粒子膜过滤单元0.22μm第94页/共192页反渗透-离子交换纯水制备系统工作流程示意图第95页/共192页目前，对于生化分析仪用水尚无行业标准。但一般可从电阻或电导率、氯离子含量、不挥发物、悬浮物和微生物、有机物几个方面来检测水的质量。检查方法参照中国药典。临床化学实验室主张用水超纯水，以保证实验结果的准确性和仪器的正常运转。第96页/共192页第97页/共192页纯水机技术指标：⑴采用单片机控制，在线检测超纯水水质当水质低于要求时，水质报警器可自动报警，提示用户更换超纯水柱第98页/共192页⑵高水位自动关机⑶低水位自动开机⑷自动监测进水端压力。当水压不够时，主机高压泵自动停止工作，避免高压泵空转影响工作进水压要求≥0.2Mpa第99页/共192页⑸反渗透膜自动冲洗⑹在线监测反渗透水电导率，以提示用户及时更换反渗透膜第100页/共192页⑺水质：18.3～1MΩ/CM，25℃⑻产水量：40～140L/h⑼进水水源：自来水⑽电阻率仪量程0～20MΩ/CM，分辨率0.1MΩ/CM第101页/共192页第四部分全自动生化分析仪分析参数设置第102页/共192页

生化分析仪的参数即仪器工作的指令，操作者通过参数控制仪器完成一系列复杂而有序的操作程序。第103页/共192页

参数种类很多，有些参数是在生产制造中设置好的，如分析仪的一些通用操作，取样、冲洗、检测、数据处理等，其程序均已经固化在存储器里，用户不能修改，只需选择即可工作。第104页/共192页

另外一些参数属于测试项目的指令，即测定参数第105页/共192页

在我国目前临床化学常规测定中，使用的分析系统一般有两种。第106页/共192页

一种是使用原厂家提供的试剂、校准品和仪器，即所谓的“封闭系统”。这类系统的测定参数固化在仪器中，除由于批号改变需要更改校准的定值外，其他测定参数一般勿需更改。第107页/共192页

商品试剂带有与之配套的校准品，这类商品试剂规定了不同型号生化分析仪的测定参数，以保证测定结果的量值溯源。这一类测定系统称为“开放的配套系统”。为了保证测定结果的溯源符合试剂出品商的声明，必须严格按照试剂说明书输入测定参数。Why?第108页/共192页ISO15189对检验程序的要求第109页/共192页正确度(truness)第110页/共192页第111页/共192页第112页/共192页第113页/共192页第114页/共192页第115页/共192页常规测量程序第116页/共192页第117页/共192页第118页/共192页indirectstandardisationviahumanpoolseraReferenceReferencemethod humansera RoutinemethodReferencestandardisationofmastercalibrator

(母校正品定值方案)

第119页/共192页RoutinemethodwithMaster-lotcalibratorReferencemethod/material5humanpoolsera

mastercalibratorMaster-lotcalibratorismathematicallyadjustedviatheformulay=ax+bsothatslope(a)=1andintercept(b)=0indirectstandardisationviahumanpoolsera第120页/共192页SalescalibratorMastercalibratorRoutinemethodconcentration[c]Routinemethodabsorbance[A]ValueassignmentincalibratorsaleslotsThesaleslotsareassignedasunknownsampleswiththemasterlotcalibratoronanalyzerwiththeroutinemethod第121页/共192页主（母）校准品赋值两条途径

使用人混合血清，通过与参考方法的方法学比较的间接校准。使用一级标准(参考物质如.NIST)的直接校准。pictureplaceholder第122页/共192页

用于对商品校准品和控制品的赋值。源于常规产品的一个生产批号，与商品校准品具有相同基质。储存于-80℃稳定约2年。

工厂母校准品（MasterCalibrator）

又：主校准品第123页/共192页小结：必须严格按照厂家提出的要求，正确输入测定参数；与特定系统配套的校准品不可用于其它测定系统。否则，会影响到测定的准确性。第124页/共192页

测试项目参数有很多，根据功能可以将其分为三个部分检测参数校准参数监测性参数第125页/共192页一、分析检测参数分析检测参数是指项目分析应具备的基本参数，包括被分析项目：名称单位检测方法主/副波长反应方向试剂量和样品量反应时间和计时时间第126页/共192页1．被分析项目名称项目名称常以项目的英文缩写来表示

ALTPchEDBilUaTBAASTGluTCUreaALPHbA1CTGSCrGGTAlbHDL-CCCrLDHTPLDL-Chs-CRPCKpreAlbApoAIASOAmylaseTBilApoBAFReftoTietzFundamentalsofClinicalChemistry第127页/共192页2.单位(Unit)

临床化学检验中的计量单位应为法定计量单位。第128页/共192页

离子如钾、钠、氯、总碳酸氢盐以及含量较大的代谢物如葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯、尿素、L-乳酸、β-羟基丁酸的计量单位为mmol/L.对于含量相对较低的代谢物，如尿酸、胆汁酸等，其计量单位为μmol/L。第129页/共192页

1979年国际生化学会为使酶活性单位与国际单位制（SI)相一致，规定1个催量的每单位为：规定的条件下，1秒钟转化的1mol底物的酶量。酶的计量单位为“katal”(符号kat)，含量以Kat/L表示。由于katal/L单位较大，临床仍以U/L表示，前者转化为后者需乘以16.67。第130页/共192页1U:umol/min1kat:mol/s1kat=16.67U1U=1umol/min=(1/1000)/(1/60)mol/s1kal=(1/60)/(1/1000)U

第131页/共192页

对于蛋白，包括总蛋白、白蛋白以及其他体液中的特定蛋白的浓度单位根据含量的大小以g/L或mg/L等单位表示。第132页/共192页2.反应温度选择

IFCC推荐的酶催化活性浓度测定温度为37℃。临床化学实验室所做其他项目，如血糖、血脂等也都用37℃测定。第133页/共192页1979年，IFCC制定了酶活性测定的总则，提出酶测定的条件，如底物浓度、pH、缓冲液种类和浓度、辅酶和辅因子以及测定的延滞期、测定酶活性的时间间隔等，应控制在最适条件下，以保证酶具有最大的催化活性。此后其陆续发布了AST、ALT、LDH、CK、GGT、ALP、AMY等酶在30℃测定参考方法;

第134页/共192页第135页/共192页IFCC第一批发布的酶测定参考方法规定酶反应温度为30℃，是因为金属镓的熔点为29.9℃容易标化。但在实际工作中，当室温超过25℃时，生化分析仪控制酶反应温度有困难。

2002年又重新发布了37℃新的测定参考方法（见表1）。第136页/共192页3.波长选择单波长多选在指示物最大吸收波长处此时检测具有最高的灵敏度和最好的稳定性。第137页/共192页双波长由于生化分析仪多采用光电二极管阵列检测，很容易做双波长检测。双波长检测的原理是同时检测两个波长下的吸光度，即用主波长的吸光度减去副波长的吸光度来计算待测物的含量。第二波长，即副波长设置的主要作用来补偿发光灯每次闪动给结果造成的差异。第138页/共192页副波长的选择原则：副波长应趋近于主波长，但吸光度应为“0”。如干扰物（内源性色源，如溶血、乳糜）在主波长和副波长处吸收量相同，那么副波长的设置就可以有效地减少干扰物造成的偏差。第139页/共192页

副波长如果设置的不合适，会导致实验结果出现系统偏差。例如，以NADH为指示物的测定项目，选择340nm为测定波长，副波长应选在400nm左右合适，如选在380nm，因为380nm处NADH具有吸收，会影响测定结果。染料结合法来测定某些物质的含量；

第140页/共192页

很多染料在可见区就有吸收，此时应观察不同浓度待测物与染料结合后是否有等吸收的波长，如有，则应选择等吸收处作为测定的第二波长。第141页/共192页4.测定方法与读点时间的选择

（1）终点法：一定反应条件下反应达到平衡，反应液的吸光度不再增加(或降低)，吸光度的增加(或降低)与被测定物的浓度成正比。第142页/共192页

应用终点法测定的项目有血清总蛋白、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸、总胆固醇、甘油三酯、总胆红素、结合胆红素、高密度脂蛋白-胆固醇、铁、钙、镁等。这类测定检测的波长一般都在可见光区，受样本色源的影响小。

终点测定法是最常用的分析法。优点是吸光度信号变化大，吸光度稳定，对孵浴温度的精度、时间等的要求不高，所以重复性好、精密度高。第143页/共192页

对于用酶作为催化剂来检测代谢物的测定，反应的级别为一级，反应体系中各组分的含量均较大，反应达到平衡的时间一般为2-3min。如反应达到平衡的时间过长，说明试剂的质量不高或试剂失效。对于化学测定方法，反应一般比较迅速，一般在反应后1-2min反应就可以达到平衡。第144页/共192页根据监测读点的不同，终点法还可以分为：①一点终点法：生物样品与相应的试剂在反应系统（反应杯）内充分混合，在一定温度下，经过一定时间的反应，通过比色系统测得反应平衡后在特定的波长下吸光度值，读取的吸光度值由微机系统处理并计算测定结果。第145页/共192页②两点终点法：生物样品与所用双试剂中试剂1充分混合，在一定温度下孵浴一定时间时，在特定波长下，读取吸光度值，然后加入启动反应试剂启动主反应，在反应达到平衡时，第二次读取吸光度值。两次吸光度差值由微机系统处理并计算测定结果。第146页/共192页

两点终点法的优点是可以减低样本空白对测定的影响。但由于第一试剂的组成（如pH等）和第二试剂不同，所以两点终点法对于内源性色原对测定的干扰的排除可能是有限的。要确认色原物质对测定影响的程度仍然必须做干扰实验。

第147页/共192页（2）一级动力学法：动力学法的概念是与终点法相对而言的，测定的是反应动态过程中的吸光度的变化。一级动力学法测定的是反应动态过程中吸光度的变化，该变化与待测物的浓度成正比。第148页/共192页第149页/共192页

（3）零级动力学法指反应速度与被测定物浓度的零次方成正比，与被测定物浓度无关，在反应时间内，测定溶液在某一波长下吸光度均匀地减小或增加，减小或增加的速度与被测物的活性或浓度成正比。零级动力学法即通常所说的速率法，也被称为连续监测法，主要用于酶活性的测定。如丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、γ-谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。第150页/共192页

Vmax［S］VO=Km+［S］米-曼氏方程最大反应速率底物浓度米氏常数反应速度第151页/共192页S>>Km1km50%Vmax2km66%3km75%4Km80%10km90%11km12km第152页/共192页

底物的种类和浓度一级反应零级反应

一般选择Km最小的最适底物，酶测定时底物浓度最好为Km的10～20倍。第153页/共192页S>>Km1km50%Vmax2km66%3km75%4Km80%10km90%11km12km第154页/共192页nm200340405A第155页/共192页A=ECLΔA/min=E×ΔC/min×LU/L=ΔA/min×(1/E)×(1/L)第156页/共192页酶催化活力浓度，应采用配套的校准物校正第157页/共192页－底物的种类（由酶的特异性决定，可以不同）及其浓度－激活剂及其浓度---抑制剂－催化反应的方向－缓冲系统及其pH－反应物质－温度－预温时间－延迟时间－反应时间---样本量---试剂量---测定波长---光径第158页/共192页

最适反应条件连续监测参数设置校准和溯源第159页/共192页催化活性（catalyticactivity）在特定测量系统中，特定化学反应转化被催化物质速率相关的组分特性催化浓度（catalyticconcentration）

测定的是酶促反应初速度零级反应

酶催化活性浓度测定特点第160页/共192页3、连续监测参数4、校准和溯源第161页/共192页第162页/共192页(ΔA/min)样

U/L=————————×C标

(ΔA/min)标第163页/共192页5.反应方向反应方向分正向（Positive或Increase）和负向（Negative或Decrease）两种，吸光度增加者为正向反应，下降者为负向反应。第164页/共192页6.试剂量(Reagentvolume)

样品量（Samplevolume）

1μl起步精确到0.1μl

第165页/共192页

试剂的剂型可以分为单试剂、双试剂，加试剂的过程则相应的有单试剂方式、双试剂方式。目前生化分析仪大多采用双试剂分析，它可以提高试剂的稳定性和抗干扰性。对于不同的机型，第一试剂量、第二试剂量、第三试剂量和总反应量有不同的取量范围，在设置取量参数时，应注意体积的上限和下限。第166页/共192页

样品体积与反应液总体积的比值是方法学基本参数；样品占总体积比例应在10％以下。含量低、吸光度低的被测吸光物质，样品用量较大；而方法灵敏、吸光度高的实验方法，样品用量较小；样品试剂比增大，样品内源性干扰增加，方法特异性会下降；比例减少，检测信号偏低，信噪比(噪音／信号)增大，精密度下降，偶然误差会增加。第167页/共192页

样本/试剂用量及其比，应以试剂说明书为准，不宜轻易改动。第168页/共192页7.反应时间（Reactiontime）计时时间（Readtime）第169页/共192页

反应时间:指分析仪一个检测周期的时间，一般小于10分钟。多数全自动生化分析仪可以连续监测整个反应周期。计时时间:读取该时间段吸光度的变化，计算样本浓度。第170页/共192页终点法动力学法一级反应延迟期一级反应期零级延迟期零级反应线性期

第171页/共192页吸光度A时间T试剂空白界限底物耗尽界限动力学法测定反应进程曲线第172页/共192页8.底物