犬小孢子菌的学习教案

犬小孢子菌的学习教案第1页/共36页研究背景1.儿童皮脂腺发育不完全2.犬小孢子菌蛋白酶的作用犬小孢子菌儿童头癣发病机制推测儿童头皮是否诱导犬小孢子菌毒力因子

？第2页/共36页材料前期试验克隆：菌液PCR，菌液克隆

主要试剂：

1.DIGHighPrimeLabeling&DetectionStarterKitI2.杂交膜

3.RealtimePCRKit

主要仪器：

1.CL1000紫外交联仪（UVP）

2.AppliedBiosystems7500RealTimePCRSystem第3页/共36页儿童头皮培养菌株(tester)儿童光滑皮肤培养菌株(driver1)成人头皮组织培养菌株(driver2)

斑点杂交实时PCR技术路线获得差异基因前期完成试验消减文库SSH第4页/共36页方法---斑点杂交正反向消减文库PCR扩增制备探针酶切回收杂交膜DIG-HighPrimer

探针菌液PCR产物第5页/共36页阳性克隆测序阳性克隆菌液送大连宝生物测序：菌种为DH10B，载体为PMD-T18测序使用引物为：FPrimer（M13-47）；RPrimer（RV-M）第6页/共36页测序分析序列预处理去除混杂基因同源性比对功能分类第7页/共36页实时PCRTestermRNADriver1mRNADriver2mRNA2个基因

2个基因

18SrRNA

3个RNA池均为构建消减文库时保存的总RNA

第8页/共36页探针引物序列第9页/共36页结果—消减文库酶切前后结果第10页/共36页结果---斑点杂交消减文库1斑点杂交部分结果正向反向第11页/共36页正向反向消减文库2斑点杂交部分结果

结果---斑点杂交第12页/共36页阳性克隆测序及分析

共得到106个有效序列共得到13个ESTs8个ESTs找到了同源基因6个同源基因具有功能分类第13页/共36页消减文库1差异基因比对结果第14页/共36页消减文库2差异基因比对结果第15页/共36页蛋白功能分类第16页/共36页实时PCR--18srRNA18srRNA基因在3个RNA池中的实时PCR表达情况

第17页/共36页FSH1基因在testerRNA池和driver1RNA池中的实时PCR表达情况

实时PCR--FSH1第18页/共36页PQ-LRP基因在testerRNA和driver1RNA池中的实时PCR表达情况

实时PCR--PQ-LRP第19页/共36页

P-GAL4基因在testerRNA池和driver2RNA池中的实时PCR表达情况

实时PCR--P-GAL4第20页/共36页NADH1基因在testerRNA池和driver2RNA池中的实时PCR表达情况

实时PCR--NADH1第21页/共36页4个ESTs表达的相对表达倍数关系

第22页/共36页讨论犬小孢子菌致病因子表达犬小孢子菌主要致儿童头癣儿童头皮组织结构蛋白差异利用SSH可能影响第23页/共36页讨论Tester和driver作为探针低丰度基因的丢失正反向消减DNA作为探针避免低丰度基因的丢失高背景，阳性率降低去掉接头降低背景，筛选差异基因第24页/共36页实时PCR实时监测

高特异性高灵敏性

讨论第25页/共36页儿童头皮培养菌株儿童光滑皮肤培养菌株构建文库富集差异基因成人头皮培养菌株讨论第26页/共36页讨论--FSH1目前对FSH1的研究主要是对其结构的分析FSH1是酯酶，水解疏水磷酸酯、油酯化合物FSH家族功能较多：蛋白酶作用、调控因子作用等FSH1在此发挥蛋白酶作用还是调控因子作用还不清楚SophieQuevillpn-cheruel

第27页/共36页讨论--PQ-LRPPQ-LRP蛋白是膜绑定蛋白，拥有一对重复的环结构（环1和环2）环2对半胱氨酸载体定位于溶酶体至关重要半胱氨酸载体调控半胱氨酸代谢PQ-LRP基因的上调表达，可能与半胱氨酸的代谢增强有关PQ-LRP基因可能是犬小孢子菌的重要致病因子

第28页/共36页讨论--NADH1NADH1是呼吸链的组成部分，参与ATP的生成犬小孢子菌ATP利用率的增加，可能与其在儿童头皮组织中生长更活跃有关第29页/共36页讨论--P-GAL4P-GAL4基因属于GAL4家族，含有一个真菌中独有的GAL4域GAL4家族普遍的功能是转录调节，主要调控氮源代谢、生殖繁殖等在本研究中，P-GAL4基因在此可能是调控真菌的生殖，导致犬小孢子菌在儿童的头皮组织中大量繁殖，导致头癣的发生第30页/共36页结论SSH1文库得到5个差异基因：

1.FSH12.PQ-LRP3.multidrugresistanceproteinMDR4.RINGzincfingerprotein5.RINGzincfingerprotein,putative第31页/共36页结论SSH2文库3个差异基因：

1.P-GAL42.NADH13.DNA-directedRNApolymeraseIsubunit第32页/共36页结论FSH1和PQ-LRP基因可能在犬小孢子菌致头癣的发病机制中起重要作