荧光显示细胞器和细胞凋亡

荧光显示细胞器和细胞凋亡第1页，共22页，2023年，2月20日，星期二膜相结构细胞膜核被膜线粒体内质网高尔基体溶酶体过氧化物酶体非膜相结构细胞骨架微管微丝中间纤维核骨架，核纤层细胞结构染色质，染色体，核仁，核糖体第2页，共22页，2023年，2月20日，星期二4人一组细胞核的荧光显示P60-62线粒体的荧光标记P70内质网的荧光标记P64-67细胞凋亡的形态学观察第3页，共22页，2023年，2月20日，星期二常用荧光染料的激发及发射波长

FluorescentDye

Excitation（激发频谱，nm）

Emission（发射频谱，nm）

Cy2TM

489

506

GFP(RedShifted)

488

507

YO-PROTM-1

491

509

YOYOTM-1

491

509

Calcein

494

517

FITC

494

518

FluorXTM

494

519

AlexaTM488

490

520

Rhodamine110

496

520

ABI,5-FAM

494

522

OregonGreenTM500

503

522

OregonGreenTM488

496

524

RlboGreenTM

500

525

RhodamineGreenTM

502

527

Rhodamine123

507

529

MagnesiumGreenTM

506

531

CalciumGreenTM

506

533

TO-PROTM-1

514

533

TOTO®-1

514

533

ABI,JOE

520

548第4页，共22页，2023年，2月20日，星期二FluorescentDye

Excitation（激发频谱，nm）

Emission（发射频谱，nm）BODIPY®530/550

530

550

Dil

549

565

BODIPY®TMR

542

568

BODIPY®558/568

558

568

BODIPY®564/570

564

570

Cy3TM

550

570

TRITC

547

572

MagnesiumOrangeTM

550

575

Phycoerythrin,R&B

565

575

RhodaminePhalloidin

550

575

CalciumOrangeTM

549

576

PyroninY

555

580

RhodamineB

555

580

RhodamineRedTM

570

590

Cy3.5TM

581

596

ABI,ROX

588

608

CalciumCrimsonTM

590

615第5页，共22页，2023年，2月20日，星期二FluorescentDye

Excitation（激发频谱，nm）

Emission（发射频谱，nm）

TexasRed®

595

615

NileRed

549

628

YO-PROTM-3

612

631

YOYOTM-3

612

631

R-Phycocyanin

618

642

C-Phycocyanin

620

648

TO-PROTM-3

642

660

TOTO®-3

642

660

DiDDilC'(5)

644

665

Cy5TM

649

670

Thiadicarbocyanine

651

671

Cy5.5

675

694第6页，共22页，2023年，2月20日，星期二1.细胞核的荧光显示P60-62

吖啶橙（AcridineOrange)

吖啶衍生物之一，它既可嵌入DNA双链间与双链DNA结合，经蓝光激发后发出亮绿色荧光，又可以静电堆积的方式与单链DNA或RNA的磷酸根结合，蓝光激发下发出橘红色荧光，从而清晰的显示DNA,RNA。异染色质（核内深染）和常染色质（核内浅染）第7页，共22页，2023年，2月20日，星期二实验方法:P621.将生长有培养细胞的盖玻片（注意细胞面向上）置于一次性小培养皿内，加入95％乙醇固定15－30分钟，取出自然干燥；2.加入1％醋酸酸化30秒；3.在盖玻片标本上滴加0.01％吖啶橙染液，染色5－10分钟；4.去染液，用磷酸缓冲液冲洗1分钟；5.用1/10氯化钙分化30秒－3分钟；6.用PBS漂洗玻片3次，每次数秒；7.临时封片：滴1－2滴PBS于载玻片上，将含细胞的盖玻片反扣其上，置荧光显微镜下用100X物镜观察。第8页，共22页，2023年，2月20日，星期二细胞核呈绿色（DNA),细胞质呈橙红色。第9页，共22页，2023年，2月20日，星期二2.线粒体的荧光标记P70罗丹明123－－特异性的线粒体荧光染料,是膜电位敏感的阳离子荧光素，活细胞线粒体具有大量质子积累造成的外正内负跨膜电位，吸引染料并将它保持在线粒体中,经蓝光激发,呈现黄绿色荧光.可作为线粒体膜电位的灵敏指示.罗丹明123结构式第10页，共22页，2023年，2月20日，星期二电子传递和氧化磷酸化的偶联第11页，共22页，2023年，2月20日，星期二实验方法:P71取出已培养好细胞的盖玻片，用PBS(+)冲洗3次，每次漂洗浸泡2--3分钟，2.加入罗丹明123标记液，37℃培养箱孵育15分钟，3.吸去标记液，PBS液洗3次，每次3--5分钟，4.临时封片：滴1－2滴缓冲液于载玻片上，将含细胞的盖玻片反扣其上，置荧光显微镜下用100X物镜观察。第12页，共22页，2023年，2月20日，星期二细胞核附近发绿色荧光的圆形或短杆状颗粒即为线粒体第13页，共22页，2023年，2月20日，星期二3.内质网的荧光标记P64-671.材料培养细胞爬片2.试剂储存液：0.5mg/mLDIO-C6(3)存储液，4℃避光，标记液：2.5ug/mLDIO-C6(3)，

4℃避光。

0.5%戊二醛第14页，共22页，2023年，2月20日，星期二实验方法:P67取出已培养好细胞的盖玻片，用0.5%戊二醛PBS溶液固定细胞10分钟，2.吸去固定液，用PBS液洗3次，每次漂洗时浸泡

3--5分钟2.滴加DIO-C6(3)荧光染液，室温染色1分钟，3.吸去标记液，PBS液洗3次，每次5分钟，4.临时封片：滴1－2滴缓冲液于载玻片上，将含细胞的盖玻片反扣其上，置荧光显微镜下用100X物镜观察。第15页，共22页，2023年，2月20日，星期二第16页，共22页，2023年，2月20日，星期二4.细胞凋亡细胞凋亡（Apoptosis）又称程序性细胞死亡（Programmedcelldeath简称PCD），是由基因编程控制的细胞主动参与的自杀过程，是一种生理性调节机制，与细胞坏死的死亡机制是完全不同。细胞凋亡是细胞衰老自然死亡的主要方式之一，在机体中承担着重要的调控作用。它不仅在维持细胞群体数量的稳定、胚胎发育和免疫系统的克隆选择方面，而且在肿瘤发生、发展、抗肿瘤药物的治疗等方面均具有十分重要的作用。第17页，共22页，2023年，2月20日，星期二第18页，共22页，2023年，2月20日，星期二第19页，共22页，2023年，2月20日，星期二凋亡(Apoptosis)坏死(Necrosis)（1）定义：一种与遗传机制有关的(即由基因调控的)主动的、自发死亡的方式，无炎症反应。外在的致损伤因素作用达到一定强度，持续一定时间后所导致的细胞死亡（被动），有炎症反应。（2）形态学观察

细胞核：核浓缩、碎裂(染色质浓缩→有规律性、断裂成核碎片)，有新月形凋亡小体。细胞器：完整细胞膜：完好细胞体积：细胞浓缩在组织中：常呈单个细胞发生

核溶解(无规律的染色质团块→溶解)无规律性。崩解尚失去完整性细胞肿胀常成群细胞发生细胞凋亡与坏死的区别第20页，共22页，2023年，2月20日，星期二（3）、生物化学检测核DNA有规律断裂50～300kb/或180bp左右的片断凝胶电泳：呈梯形条带(ladder)DAPI萤光染色，片状、颗粒状核荧光。流式细胞仪检测：可见亚G1峰(AP峰)

核基因表达：必须

DNA酶活性：必须蛋白激酶活性：必须细胞器环境：Na+/K+泵功能完好

DNA无规律地断裂条带不清（smears）无颗粒或片状核荧光出现无此峰

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功能丧失第21页，共22页，2023年，2月20日，星期二

细胞凋亡形态学观察荧光显微镜观察法