灭菌工艺及设备验证

灭菌工艺及设备验证第1页/共102页灭

菌工艺及灭菌设备验证第2页/共102页一般指没有活体微生物存在的药品。在药品制剂类别中，无菌药品也可称为无菌制剂无菌药品是指法定药品标准中列有无菌检查项目的制剂和原料----«药品生产质量管理规范»（2010年修订）附录1.无菌药品

无菌药品基本概念？第3页/共102页106100（1）10-6（10-3）无菌保证水平（SterilityAssuranceLevel）---SAL基本概念采用湿热灭菌法的SAL不得大于10-6，即灭菌后微生物存活的概率不得大于百万分之一采用无菌生产的SAL不得大于10-3无菌生产工艺仅限于临床必需注射给药而确实无法耐受终端灭菌的产品,适用于粉针剂或部分小容量注射剂SAL定义----产品经灭菌/除菌后微生物残存的概率。评价灭菌（无菌）工艺的效果，该值越小，表明产品中微生物存在的概率越小。第4页/共102页无菌制剂主要有：注射剂植入剂、冲洗剂、眼内注射溶液、眼内插入剂供手术、伤口、角膜穿通伤用的眼用制剂，用于手术、创伤、烧伤或溃痒等的软膏剂、乳膏剂、气雾剂、喷雾剂局部用散剂、耳用制剂、鼻用制剂、凝胶剂基本概念第5页/共102页注射剂药途径特点基本概念直接进入组织或血液吸收快作用迅速可靠注射液注射用无菌粉末注射用浓溶液肌肉注射静脉注射注射剂与其他剂型相比

无菌制剂,质量要求高生产过程控制严格注射剂---将药物制成无菌溶液、混悬液或临用前制成液体的无菌粉末供注入人体的制剂.

是临床上使用广泛的制剂。第6页/共102页无菌无热原无不溶性微粒高纯度

无菌药品特点？基本概念第7页/共102页微生物\微粒药物降解（氧化、水解）基本概念过滤、消毒、灭菌工艺控制（PH、温度、时间、空气）第8页/共102页注射剂生产的基本要求合理的厂房、设备、措施设计合格的人员合理的生产方法、步骤和控制方法工艺验证和方法灭菌工艺验证生产场所设施设备重要的支持系统原材料包装材料产品设计分析化验规程仪器校准操作人员验证过的工艺硬件软件人员第9页/共102页微生物基础知识真核微生物原核微生物病毒有细胞结构微生物无细胞结构微生物--是指一类体积微小、结构简单，大多是单细

胞的，必须用光学显微镜观察形态的微小生物的通称。肉眼看不见、看不清楚的微小生物第10页/共102页三型八大类特点无细胞结构病毒（亚病毒和朊粒）无细胞结构，结构最简单，体积最微小，能通过细菌滤器；

由单一核酸（DNA或RNA）和蛋白质外壳组成；

必须寄生在活的易感细胞内生长繁殖。原核细胞细菌\放线菌螺旋体\支原体衣原体\立克次体仅有原始核，无核膜、无核仁，染色体仅为单个缺乏完整的细胞器。真核细胞真菌细胞核分化程度较高，有典型的核结构（有核膜、核仁、多个染色体，由DNA和组蛋白组成）；

通过有丝分裂进行繁殖；

胞浆内有多种完整的细胞器。微生物基础知识第11页/共102页个体小，作用大。分布广，种类多。生长繁殖快，代谢强。易变异。微生物基础知识微生物生物学特征20min第12页/共102页植物叶子表面附生微生物----

皮肤上含细菌------------------洗过后几小时之内-------------人的肠道内微生物-------------粪便中细菌----------------------一般人每个喷嚏的飞沫-------感冒患者一个喷嚏-------------微生物基础知识简介约100万个/克。约10万个/cm2恢复到原来的数量约100万亿大约占粪便干重的1/3含4500-150000个含8500万个（有传染性）微生物无处不在第13页/共102页常见微生物微生物基础知识简介种类基本特点生长条件细菌0.5～5μm，生长态时不耐热，部分能形成耐热芽孢.30-35oC,1-2天真菌5μm～50μm，形成芽孢随空气扩散，不耐热,但难用消毒剂消毒20-25oC,3-5天病毒小于0.1μm，一般不耐热，0.22μm过滤不了第14页/共102页微生物分布特点G+G-气源性微生物革兰氏阳性菌较多可形成芽孢，难以杀灭药品生产需要HVAC水源性则革兰氏阳性菌居多不会生成孢子，会形成细菌内毒素耐热性差微生物的芽孢，并不是繁殖的手段，而是休眠体。生物指示剂均为革兰氏阳性菌，灭菌用BI为非致病菌。第15页/共102页细菌芽胞的形成及其特性成熟芽孢孢子壁母细胞孢子壁的形成生长态细胞摘自/microbes/spores.asp内生孢子产生于Gram+

细菌:

芽孢杆菌属Bacillus

梭菌属Clostridium

仅含核酸及少量萌发必需物，皮层含DPA和Ca2+复合物，能抵御各种恶劣环境，可休眠上百万年。真菌孢子因不具上述特性，而不耐热。（DPA：吡啶二羧酸）第16页/共102页常用的灭菌方法二种：物理灭菌法和化学灭菌法物理灭菌技术是利用蛋白质与核酸具有遇热、射线不稳定的特性，采用加热、射线和过滤方法，杀灭或除去微生物的技术称为物理灭菌法，亦称物理灭菌技术。该技术包括干热灭菌、湿热灭菌、除菌过滤法和辐射灭菌等。化学灭菌法系指用化学药品直接作用于微生物而将其杀灭的方法，可分为气体灭菌剂和液体灭菌剂，如环氧乙烷属于气体灭菌剂的一类。一旦温度超过上限，微生物细胞中主要的蛋白质、酶及核酸便会被永久性破坏，细胞膜被融解，从而导致细胞发生不可逆转的死亡。热力学灭菌是使用最普遍并且研究最为彻底的灭菌方式。灭菌基本原理第17页/共102页灭菌基本原理微生物的耐热性可按下列顺序排列(耐热性从高到低):绝大多数细菌≤45℃不能生长，80～100℃可被迅速杀灭。需氧菌中的芽胞杆菌属厌氧菌中的梭状芽胞杆菌属具有较强的耐热性第18页/共102页物理/化学条件在较高温度下生长有二价阳离子温度和相对湿度在90～125℃之间，相对湿度在20%～50%时，细菌芽胞表现出最大的耐热性当相对湿度超出这一范围时，芽胞的耐热性将会迅速下降。湿度对芽胞破坏性过程起促进作用，所以湿热灭菌较干热灭菌较低温度。

影响热力灭菌的因素第19页/共102页湿热灭菌法系指物质在灭菌器内利用高压蒸汽或其他热力学灭菌手段杀灭细菌。（一定压力下的蒸气进行灭菌，也采用过热水喷淋或浸没）。湿热灭菌法系导致细胞内的关键性蛋白质和酶发生热变性或凝固。具有穿透力强，传导快，灭菌能力甚强。【水由液态变成气态时，会吸收大量的热能(540cal/g)，气态冷凝成液态时，会释放相等的能量(即汽化热)】。因此应尽可能使用饱和蒸汽进行灭菌。湿热灭菌是一种十分经济有效的方法。用于药品、药品的溶液、玻璃器械、培养基、无菌衣、敷料以及其他遇高温与湿热不发生变化或损坏的物质，均可选用。常见湿热灭菌器包括脉动真空灭菌器（或称预真空灭菌器）、蒸汽-空气混合物灭菌器和过热湿热灭菌水灭菌器等。湿热灭菌第20页/共102页干热灭菌是指在非饱和湿度下进行的热力学灭菌。灭菌介质通常为被灭菌品所处湿度下的热空气干热灭菌是使微生物氧化而不是蛋白质变性，这就是干热灭菌之所以要求相对较高温度的原因。利用干热灭菌工艺灭菌温度高、时间长的这一特点如170-250℃，甚至更高，可使干热灭菌同时具备除热原的功用。干热是去热原最为有效的方法之一。干热去热原工艺进行验证，应证明该工艺能使标准内毒素至少下降3个对数单位。

在制药工业中，干热灭菌被广泛用于不耐受高压蒸气的热稳定性物品的灭菌。如玻璃、金属设备、器具，不需湿气穿透的油脂类（甘油、油类、凡士林、石蜡），耐高温的粉末化学药品（滑石粉、磺胺类药物）等，但不适用于橡胶、塑料及大部分药品。革兰阴性细菌细胞壁中的脂多糖----内毒素。低剂量内毒素会导致人体发热反应，故而也称之为热原。干热灭菌第21页/共102页使用范围可分为试验室器具用，生产制剂用，生产器具用干热灭菌设备。按使用方式分为连续式和批量式，批量式干热灭菌设备如干热烘箱，可用于内毒素检验用玻璃、金属器具的灭菌和除热原，以及生产设备部件、生产器具的灭菌除热原；连续干热灭菌设备，如隧道烘箱，可用于小容量注射剂的生产。按加热方式可分为：以辐射加热为主的热辐射式干热灭菌机和以对流加热为主的热层流加热式干热灭菌机等。干热灭菌第22页/共102页在特定温度下，任一时间点的芽胞死亡特性仅与这个时间点的芽胞浓度相关。微生物的热致死特性Y轴及X轴均为普通座标（示意）tN102030101001000半对数座标Y轴：微生物取对数X轴：时间为10进制普通座标tlgN102030123第23页/共102页无菌的影响因素可用下式表示:PNSU=N0-DR

PNSU指非无菌品概率N0指灭菌前产品的污染水平DR指灭菌时的杀灭水平。

最终产品的无菌质量取决于两个因素灭菌前的含菌量控制灭菌工艺的杀灭效果。第24页/共102页微生物的热致死特性：受热死亡速度符合一级动力学方程dN/dt＝K(N0－Nt)N0为t＝0时，存活的微生物数；

Nt为t时被杀灭的微生物数；

N为t时存活的微生物数

K为常数。将上式积分得到：lgNt＝lgN0－(K／2.303)t第25页/共102页专业名词D值在一定温度下将微生物数量杀灭90%或下降一个对数单位所需要的时间z值灭菌温度系数即指使微生物D值改变(增加或减少)一个对数单位时，温度应变化(降低或升高)的度数。是耐热曲线或热致死时间曲线斜率的负倒数FTT℃灭菌时间指灭菌程序赋予被灭菌品在T℃下的等效灭菌时间F0标准灭菌时间将121℃作为标准灭菌温度，当z设定为10℃时，灭菌程序赋予被灭菌品121℃下的等效灭菌时间第26页/共102页它是分析灭菌工艺效果的重要生物学参数。并且其数值可通过残存曲线法或阴性分数法加以确定。lgN0－lgNt＝lg（N0／Nt）＝Δt(K／2.303)＝lgl0＝1,所以D=Δt=2.303／K.即：D是直线斜率的负倒数D值越大，该温度下微生物的耐热性就越强，在灭菌中就越难杀灭。lgNt1234t1t2D第27页/共102页对某一种微生物而言，在其他条件保持不变的情况下，D值随灭菌温度的变化而变化。灭菌温度升高时，直线方程的斜率变大，即使微生物杀灭90％所需的时间就短灭菌温度低时，达到同一灭菌效果的时间就长115℃121℃125℃lgNt△lgN=1D125D121D115第28页/共102页微生物名称温度／℃介质D值／min嗜热脂肪杆菌105葡萄糖87.811032.011511.71212.4微生物名称温度／℃介质D值／min梭状芽孢杆菌105葡萄糖1.3注射用水2.1微生物名称温度／℃介质D值／min嗜热脂肪杆菌121葡萄糖乳酸林格液2.1葡萄糖2.4注射用水3.0微生物名称温度／℃介质D值／min梭状芽孢杆菌105葡萄糖1.3嗜热脂肪杆菌注射用水2.1第29页/共102页在湿热灭菌条件下，实验测得细菌芽胞的z值在8-12℃之间湿热灭菌计算时z通常取10℃；干热灭菌计算时Z通常取20℃，去热原时Z通常取54℃。Z=直线斜率的负倒数,其中:D1指温度为T1时的D值，D2指温度为T2时的D值。tT（℃）D1D2121℃117℃△T△DZ=-△T/△D=(Tl-T2)/log10(D2/D1)，第30页/共102页F0＝Dl21℃×ΔLgNFT＝DT×ΔLgN达到同样灭菌效果时，ΔLgN等值lgNtLgNoLgNt121℃117℃△LgNFTFo指在某一温度T(℃)下灭菌1min所获得的标准灭菌时间所以F0／FT＝D121℃／DTL=D121℃/Di

=10(Ti-121)/ZTi指各个灭菌时段的温度标准参照温度（121℃）Z＝10℃。第31页/共102页100℃灭菌时1分钟，相当于121℃灭菌0.008分钟，即Fo值为0.008分钟。105℃灭菌40分钟时，Fo约为1分钟，能使D值为1分钟的芽孢数量下降1个对数单位116℃下灭菌lmin对芽孢杀灭效果只有标准灭菌状态下的32％121℃下灭菌lmin相当于116℃下灭菌3.16min灭菌温度℃灭菌率L1000.0081050.0251120.1261150.2511160.3161180.5011200.7941211.0001221.251231.59第32页/共102页可用灭菌率计算FT值=F0／L=8/0.316=25.3F0=∫10(Ti-T121)/Zdt=10(116-121)/10*25.3=8根据梯形规则，将整个灭菌过程(包括升温、保温和冷却阶段)的灭菌率累加，从而估算出某灭菌程序在标准温度下的等效灭菌时间：F0=Δt（L1/2+L2+L3+…+Ln-1+Ln/2）,Δt指测量温度的时间间隔。每两次测量温度的时间间隔必须相同。在初始及结束时间段的灭菌率非常小,可将公式简化为:FT=Δt∑L。L1L2L3LN-1LN100℃第33页/共102页由

FT＝(LgN0－LgNT)DT，FT／DT

＝LgN0－LgNT，则lgNT＝lgN0－FT／DT。根据灭菌设备内温度监控系统所测得的物理参数，估测某灭菌程序对微生物的杀灭效果。DT表示某实际微生物（待灭菌物品中的污染菌)或假设的微生物(生物指示剂)在T℃下的D值。例如，假设F0为8分钟，DT=0.5分钟，数量为106，由公式可以得出在灭菌结束时，芽胞的残存数量为10-10，SAL=lgNT=6-8/0.5=-10。在整个灭菌过程中，芽胞数量的对数下降值:SLR=LgN0-LgNT=FT／DT=6-(-10)=8/0.5=16。第34页/共102页生物指示剂，简称为BI，是对特定灭菌者工艺具有一定耐受性并且能够定量测定灭菌效力的微生物制剂，生物指示剂多为芽胞类细菌，具有更强的耐受性。生物指示剂既可用来测定一个给定的灭菌工艺条件的灭菌效果，也可判别它是否符合无菌保证要求。采用生物指示剂做对照试验，是评判一个灭菌程序有效性的直接方法而且也是最佳方法。第35页/共102页常用于灭菌工艺验证的生物指示剂主要有三种形式芽胞条芽胞悬浮液自含型生物指示剂

第36页/共102页芽胞条

将芽胞接种于滤纸片、玻璃、塑料等薄片或条状物，并用特定的材料包起来以保持其完整性和生物活性。直接接种到产品中.适用于验证和监控非溶液类物品的灭菌工艺.第37页/共102页芽胞悬浮液

芽胞悬浮液可被接种待灭菌产品溶液或模拟产品溶液中。直接接种于产品内或产品外表面，这样能更加直观地考察产品的实际灭菌效果。芽胞接种到液体产品时，其耐热性会增强或降低。如果不宜被直接接种于产品或耐热芽胞与产品不相适应，则可用模拟产品（生理盐水或其他溶液）替代。但必须保证所用的替代品与产品具有相似的物理和化学性质(如粘度和pH)，并且耐热芽胞在替代品中的D值（耐热性）不得小于在产品中的D值。否则将影响到灭菌工艺验证或日常监控的可靠性。第38页/共102页

自含型生物指示剂

是将芽胞条(或片)加入到含有指示剂的培养基包装内(如小瓶内)，培养基单独包装并与芽胞载体分离，经灭菌处理后，挤碎培养基小瓶使芽胞条(或片〕浸没在培养基内，在适当温度和时间内培养，通过观察培养基内的酸碱指示剂的颜色变化判断其生长状况;或将芽胞直接接种在含有指示剂的培养基内。自含型生物指示剂的耐热性与其载体、包装的材质、结构有很大的相关性；生物指示剂的包装要易于杀菌剂透过。测定D值时务必要考虑包装可能会引起杀菌效来的滞后，不能仅测定芽胞条(或片)的D值。第39页/共102页灭菌溶液时，多选用自含型安瓶瓶生物指示剂灭菌织物时，多选用芽胞条灭菌管路时，选用特殊生物指剂(如用接有芽胞的钢丝、线等)以测试死角处(最冷点)的灭菌状况第40页/共102页灭菌方式微生物（孢子）D值范围（分）湿热121℃嗜热脂肪芽孢杆菌Bacillusstearothermophilus

1.5-3.0枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis

0.3-0.7凝结芽孢杆菌Bacilluscoagulans

0.4-0.8梭状芽孢杆菌Clostridiumsporogenes

0.4-0.8干热150℃枯草芽孢杆菌黑色变种

Bacillussubtilisvar.niger

>1.0第41页/共102页注射剂无菌生产过滤除菌无菌分装（冻干）粉针剂溶液状态下稳定等注射液否是最终灭菌无菌生产否是热压灭菌残存概率法不能耐受过度杀菌法过度杀菌法注射剂灭菌工艺的选择第42页/共102页EMEA灭菌工艺决策树风险增加一般是湿热灭菌方式F0≥8，首选过度杀灭法F0≥12，如不能耐受过度杀灭，选用残存概率法8≤F0<12。第43页/共102页最终灭菌非最终灭菌生产工艺是在控制微生物污染量的基础上，在完成内包装工艺生产过程最终采取一个可靠的灭菌措施。是在无菌系统环境下，通过除菌过滤法或无菌操作法，在完成内包装工艺生产全过程始终未采取单独的灭菌措施。基本概念无菌性的过程或内容不同第44页/共102页无菌保证值与Fo、D值及带菌量的关系lgN2345-2-3-41-5-6-101234576891012分11过度杀灭示意生产中Fo=8示意SAL＝F0/D–lgN0

假定D121为1方法F0N0SAL过度杀灭法121066残存概率法81026第45页/共102页确立灭菌终点-----使微生物的残存概率下降到100，在此基础上再下降6个对数单位(即微生物的残存概率不超过1/百万，或PNSU≤10-6)灭菌过程中所产生的各项物理和生物学参数应能保证其灭菌效果达到PNSU=10-6。生物学因素物理因素1.灭菌前微生物量:N02.灭菌前微生物的耐热性:DT3.灭菌终点的残存概率:NT(10-6)灭菌值:FT灭菌工艺开发第46页/共102页FT=（lgN0-lgNT）×DT如果N0和DT已知，为使灭菌终点达到10-6的要求，可计算出灭菌前的带菌量。例如，灭菌前每个容器内含有l00个耐热芽胞，

其DT=1分钟，灭菌值F0要达到8分钟，

才能使产品中微生物降至100后，再下降6个对数单位:F0=[2-(-6)]x1=8分钟。F0=8分钟是灭菌工艺必须达到的最小目标值。也可根据灭菌设备的性能和产品的热稳定性确定F0的上限。灭菌工艺开发第47页/共102页过热灭菌时，不用考虑灭菌前含菌量。这并不意味着就不用对灭菌前含菌量进行控制。相反，控制灭菌前产品中的污染菌含量也是非常重要的。过热灭菌工艺常用于热稳定性物品的灭菌，如包装材料和生产设备等。验证时，先通过确定完全杀灭含有106个嗜热脂肪芽胞杆菌的生物指示剂（D121值为1.5分钟左右)所需的灭菌时间，再将这个时间加倍即为实际生产时的过热灭菌时间。

过热灭菌第48页/共102页建立在含菌量控制基础上的灭菌工艺，其灭菌终点是由灭菌前半成品的含菌量及所含微生物的耐热性来决定的。生产时应避免产品被耐热性微生物污染，而不能依赖于最终灭菌。有些产品在灭菌前进行无菌生产和灌装。控制灭菌前产品中的含菌量，可以降低灭菌条件，降低灭菌时对产品及其容器/密封件的潜在破坏性。对热敏性产品(如蛋白质)非常重要残存概率法第49页/共102页如果在灭菌前产品中没有耐热菌，可假设有一定数量的芽胞存在于其中(常规生产时可能会碰到的最差状况)。如设每只容器内含有D121℃=0.5分钟的耐热芽胞100个。根据与假设菌的数量及耐热性相当的实际生物指示剂(BI)来确定一个灭菌工艺的灭菌效果。根据置于灭菌产品内的测温探头的测量数据计算出理论F0值，并对多次运行的F0值进行平均，将平均F0值与从接有生物指示剂(已知胞子数量和D值)的类似容器中得到的平均SLR(sporelogreduction)值进行比较。残存概率法第50页/共102页根据生物指示剂的致死效果，估算出实际污染菌的下降水平:SLRA=SLRB×DB/DA

SLRA灭菌前产品中污染菌的对数下降值SLRB生物指示剂的对数下降值DA灭菌前微生物的(已知或假定的)D值

DB生物指示剂D值。如果DA=0.5分钟，DB=2.0分钟，121℃F0=8分钟，SLRB=

4，则:SLRA=16,SLRA=4×(2.0/0.5)=16lgNT=1gN0-SLR=2-16=-14,SAL=14。残存概率法第51页/共102页在灭菌结束时仍有一部分生物指示剂未被杀灭，但这并不意味着此灭菌程序无效。通过它们，证实了测温探头指示的F0值（8分钟)所赋予容器内物品的实际灭菌效果。残存概率法第52页/共102页只要对灭菌前的含菌量进行控制、监测并掌握其耐热性，一般是不会含有耐热芽胞的控制手段对每批的灌封开始和结束阶段，分别对灌装好的半成品取样检测。样品须作需氧菌总计数将检品液置于100℃下加热10分钟，检查是否有耐热芽孢存活须对微生物学检测结果进行趋势分析以确保半成品的微生物处于稳定的受控状态残存概率法第53页/共102页一般情况下，暴热后的样品中是检测不到微生物的，一旦发现，则需对其鉴别并测定其D值。若分离菌的D值大于灭菌工艺验证所用生物指示剂的D值，则说明灭菌程序不充分，应采取措施以消除产品中的耐热菌。如果这些措施不可行，则应采用具有更强耐热性的生物指示剂，或是从产品中分离出的耐热性微生物，对灭菌程序进行再验证。第54页/共102页生物学验证就是要用与产品灭菌工艺相适应的最苛刻条件来挑战该产品灭菌工艺的有效性、可靠性和稳定性。过度杀灭法：一般选择嗜热脂肪芽孢杆菌

。

残存概率法：一般选择梭状芽孢杆菌第55页/共102页液体产品在121℃灭菌15分钟(药典推荐的常用灭菌工艺)即被认为过热灭菌工艺。对管路、胶塞、织物以及过滤器等热穿透性较差的物品则需要更长的灭菌时间或更高的灭菌温度，方能达到过热灭菌要求（121℃灭菌30分钟）。每个指示剂的芽胞含量通常在105-107之间生物指示剂有效性当F0值≤(D×lgN0-2)时，生物指示剂均应呈阳性结果当F0值≥(D×lgN0+4)时，生物指示剂均应呈阴性结果生物指示剂第56页/共102页要掌握灭菌前产品中污染菌状况，污染菌的数量及其耐热性;测定生物剂在待验证产品及验证用标准溶液中的耐热性(D值和Z值);根据产品的最低灭菌工艺条件、灭菌前产品中的污染菌控制要求及最终产品的无菌保证要求，用相关公式计算出验证时每个生物指示剂所需要的胞子数量。生物指示剂第57页/共102页F0（分钟）76543210-1-2-3-4-5-6孢子存活数量的对数值t第58页/共102页59原料药/赋形剂量微生物检查微生物能否在原料或赋形剂中生长或存活？原料/赋形剂合成/工艺相关步骤本身是否会减少微生物？所监控的微生物量/指示菌量是否都低于规定限度？原料或赋形剂是否无菌？是否有科学证明减少步骤会造成原料/辅料中微生物量认可限度（未检出觉指示菌）？按照协调后药典各论制订微生物限度认可标准提供支持数据，不必作微生物限度检查和制订认可标准不需进一步作微生物限度检查或制订认可标准提供支持数据，不必作微生物限度检查和制订认可标准逐批检查微生物限度和指示菌抽批检验微生物限度和指示菌按照协调后药典各论制订微生物限度认可标准是否否否是是是否是否灭菌前含菌量限度以及污染菌的耐热性限度均是以原材料的微生物含量和常规监控资料为基础而建立的;灭菌条件及F0值控制是根据产品稳定性研究资料而建立的;验证用芽胞在每种产品中的实际耐热性资料由微生物实验室测得。第59页/共102页

logN0=F0/D121+logNtNt=2.303

×log(n/q)n:每次挑战试验用生物指示剂数量q:挑战试验后呈阴性的BI数量如果全都是阴性,则假定q=n-1用于计算Nt产品灭菌前含菌量控制限度CFU/瓶耐热性DC≤DBI温度×时间F0控制范围）验证用孢子在其中的耐热性D121A≤100

116℃×259-130.8分B≤100DC≤DBI116℃×258-120.9分C≤100DC≤DBI118℃×209–130.7分第60页/共102页可选择产品B代表上述三产品进行验证产品的规格相同、且在同一灭菌设备内灭菌并且灭菌工艺条件相似、以及生物指示剂芽胞在其中的耐热性也较为相近，只要验证其中的一个产品B即可，生物指示剂在其中的耐热性最高，而灭菌程序的F0值的下限低于其它二产品但验证时要以100CFU/瓶作为污染菌含量通过试验证明灭菌程序能使生物指示剂至少下降8个对数单位,所需F0为D121

×⊿log=7.2分最低F0满足要求确定验证用芽孢在每瓶产品B中的接种数量第61页/共102页验证标准溶液为氯化钠一磷酸盐缓冲液(PBS)，验证试验瓶数量为20袋/次。，产芽胞梭状菌芽胞在氯化钠一磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.0)中的耐热性为1.4分钟，高于其在产品中的耐热性，接种量:F0=D121×(1gA-1gB)

根据阴性分数法，B=2.303×log(n/q)假如所有的20只试验瓶无菌检查结果均呈阴性，在计算时可假定只有19瓶呈阴性，那么，B=2.303×lg(20/19)=0.0513,lgB=-1.29,lgA=F0/D121+lgB=8/1.4-1.29=4.4,A=104.4个菌.每个挑战瓶内的芽胞接种量可控制在104～105之间。第62页/共102页验证时，腔室内的物品应按实际生产时的要求进行装载生物指示剂的使用数量应足以反映整个物品内、外部的灭菌状况，生物指示剂既要遍布整个腔室，又要尽可能地放在热效应最差的部位，如物品中央、管路拐角以及腔室的排水口(干热灭菌的排风口)等应将生物指示剂与物理测试用温度探头放于同一位置，以准确获取物理参数与微生物致死性之间的相关性资料放置在每个位置的生物指示剂均应做好标记，并且要与验证文件中生物指示剂的验证分布图相对应第63页/共102页验证时，采用相关产品的最低灭菌条件进行灭菌处理灭菌程序结束后，将生物指示剂取出并清点数量并确认无误后，送至微生物室，于适当条件下培养检查。阳性对照以及培养基的灵敏度。在初始验证阶段，分别用生物指示剂在相同的灭菌条件下至少连续运行3次，以评价灭菌工艺条件的稳定性;在以后的定期再验证中，每次检测一批即可。验证时的生物指示剂分布、腔室内的产品装载及指示剂的控制要求均与过热灭菌工艺验证时生物指示剂的使用原则相同。第64页/共102页与过热灭菌工艺相比，残存概率灭菌工艺的灭菌效力相对较低，用商购的普通生物指示剂无法实现对残存概率灭菌工艺的验证。商购的生物指示剂一般用于验证F0值大于等于15分钟的灭菌工艺，而且在载体上的耐热性与在实际产品中的耐热性有相当大的差异。直接将芽胞加到产品溶液内，因其耐热性较高，只能加人较少数量(如Dl21值为2.4分钟，则单位验证产品中的胞子数量只能控制在100个左右才可能被完全杀灭)，这就难以直观反映实际灭菌工艺的可靠性和稳定性试验表明，嗜热脂肪芽胞杆菌芽胞在孢子纸条或注射用水中的耐热性(D121)约为1.5分，但在乳剂内的耐热性约为2.4分钟。第65页/共102页在同等条件(介质和温度)下，产芽胞梭菌芽胞的耐热性D121值在0.8-1.5分之间，并且它的耐热性也比较稳定。当验证F0值在8～12分钟的残存概率灭菌工艺时，根据产芽胞梭菌芽胞在实际产品溶液中的耐热性，可将单位验证产品中的孢子数量控制在l06个以上。因而能较直观表现实际灭菌工艺的灭菌效果。并非所有灭菌工艺都必须在最苛刻条件下进行验证，而是以灭菌工艺的实际条件及验证合格标准来制定适当的生物指示剂验证方案，从而证明相关产品灭菌工艺的可靠性第66页/共102页湿热灭菌特点蒸汽有利于蛋白质的变性和酶的失活，从而杀灭细胞蒸汽热穿透性强灭菌效率高温度相对较低灭菌时间相对短灭菌过程不产生任何化学物理污染灭菌设备控制参数少，运行稳定，方便管理灭菌柜验证第67页/共102页干热灭菌要点干热灭菌的介质通常是热空气用对数规则描述微生物杀灭过程，准确性较差温度高，200℃以上，有可能到320℃用于玻璃容器、手术器械等无菌生产工艺中安瓿、西林瓶的灭菌和去热源第68页/共102页灭菌过程的Fo示意第69页/共102页混合蒸汽-空气灭菌器该型灭菌器配有灭菌腔体、离心风机、热交换器、隔板，并连接压缩空气、蒸汽/纯蒸汽、真空泵等。当蒸汽进入灭菌柜时，风机将蒸汽和灭菌器内的空气混合并循环，将产品和空气同时灭菌。蒸汽中加入空气，即可产生一个高于一定温度下饱和蒸汽压的压力。与饱和蒸汽灭菌相比，它的热传递速率较低。混合蒸汽-空气灭菌器第70页/共102页混合蒸汽灭菌柜SAM=steamairmixture蒸汽空气混合灭菌柜混合汽体灭菌柜进蒸汽的管没画出顶上用一风扇，使灭菌均匀无风扇时，灭菌容易不均匀热交换器控制冷却速度第71页/共102页下排式蒸汽灭菌柜热蒸汽在上冷空气在下蒸汽挤空气用于实验室第72页/共102页脉动真空式蒸汽灭菌器是药品生产中所采用的最典型的高压蒸汽灭菌器，通常由灭菌腔体、密封门、控制系统、管路系统等组成，并连接压缩空气、蒸汽/纯蒸汽、真空泵等。在灭菌阶段开始之前通过真空泵或其他系统将空气从腔室移除，然后通入饱和蒸汽，反复进行真空、通入蒸汽，将空气彻底置换后进行灭菌。灭菌器设有真空系统和空气过滤系统，灭菌程序由计算机控制完成，腔体内冷空气排除比较彻底；具有灭菌周期短、效率高等特点。脉动真空式蒸汽灭菌器对物品包装、放置要求较宽，且真空状态下物品不易氧化损坏的特点，常用于对空气难以去除的多孔/坚硬装载进行灭菌，尤其适用于可以包藏或夹带空气的装载物，比如软管、过滤器和灌装机部件。脉动真空式蒸汽灭菌器第73页/共102页脉动真空蒸汽灭菌柜有高真空及脉动真空二种形式第二种比较常见抽99%，剩1%3次真空，残存的空气为0.1%密封圈第74页/共102页第75页/共102页喷淋灭菌柜该类灭菌器配置有热水储罐、热交换单元、循环风机、循环泵、旋转装置等。灭菌时，产品被固定在托盘上，灭菌水开始进入灭菌腔体，通过换热器循环加热、蒸汽直接加热等方式对灭菌水加热，喷淋到灭菌。灭菌结束后灭菌器可以对灭菌水进行回收。部分工艺可以通入无菌空气，加热循环、除水等工艺对产品进行干燥。这类过热水循环的灭菌程序都使用空气加压，保持产品的安全所需要的压力。优点是加热和冷却的速率容易控制，通常适用于软袋制品的灭菌。喷淋灭菌柜第76页/共102页旋转喷淋灭菌柜第77页/共102页干热灭菌柜常见程序：180×2小时，细菌内毒素下降3对数单位第78页/共102页隧道式洗瓶灭菌柜工作原理图瓶清洁排水汽预热去热原冷却干热灭菌层流保护洗瓶及灭菌、去热原为联动线B区第79页/共102页冰浴0.01℃油浴121℃数据采集器参照仪验证仪校准灭菌柜热分布验证试验图示第80页/共102页灭菌柜验证灭菌程序的效力测定♦生物学手段–用特定的生物指示剂作为标准微生物制剂–数据直接反映灭菌效果–有时可取代物理手段的不足(如探头无法放入安瓿瓶)–局限性：较难进行统计学分析♦物理/数学手段–用灭菌值F0作为评价标准–精确测定热分布和热穿透状况–便于准确计算不同灭菌条件下的灭菌效果–测量数据便于统计学分析第81页/共102页灭菌工艺验证灭菌工艺验证前提灭菌设备的安装确认灭菌设备的运行确认灭菌工艺的验证先对设备温度仪表和验证用仪表进行校准空载热分布－找到灭菌过程中灭菌设备的最冷点不同装载形式、不同装量规格产品的热穿透试验－产品获得的F0生物指示剂验证-微生物挑战性试验灭菌工艺条件（灭菌介质、温度时间参数、装载方式等）灭菌设备和灭菌工艺的验证第82页/共102页灭菌工艺验证方案.常包括以下内容:1.灭菌设备的构造概述(包括生产商和型号、设备结构图、运行流程图、工艺制控制流程图等)。2.所使用的具体灭菌工艺(如饱和蒸气、水浸没、水喷淋等方式)3.灭菌工艺参数和运行的标准(如温度、压力、时间、最大及最小Fo值等)。4.被灭菌物品(如装载方式、产品组分、容器大小、灌装体积、最大及最小装载量等)。第83页/共102页5.灭菌工艺的监控方法(如测温探头、模拟瓶、生物指示剂的数量及位置以及合格/不合格标准)。6.关键参数的最大/最小允许范围。7.自动及手动控制的操作步骤。8.验证时异常情况下的记录清单。9.产品所能承受的灭菌致死范围(F0值范围)。10.物理验证试验方法(热分布、热穿透试验)。11.生物学验证试验方法(生物指示剂的选择及使用方式)。12.对灭菌工艺偏差所进行的统计学评价要求及方法

第84页/共102页验证试验在确立一个灭菌工艺的灭菌终点时，必须要考虑相关的生物学和物理学因素。了解灭菌设备的运行特性对因素的影响。采用12个以上热电偶/热电阻探头测试.测试前所、后有探头校正，一般0℃和125℃两点校正，在121℃校正确认，要求与标准温度差值在±0.5℃之内。每种方式找出设备的“冷点”和“热点”。第85页/共102页1)整个灭菌腔室内的温度探头应均匀分布，将水平和垂直区均覆盖在内。

2)说明温度探头在腔室内的数量及位置，并有图示。

3)在排水口处，在靠近设备本身的温度传感/控制器的位置，应再放置一支探头。

4)在灭菌温度稳定期，各处温度应基本保持一致(各点之间的温差在±1℃范围内,与腔室平均温度间的差值及与灭菌柜设定温度的差值)。（121℃，12分，fo=12，9.5～15.1）

5)重复试验至少3次，以证明在该工艺条件下的温度均一性、重现性、并且与规定标准相符。

(一)热分布试验1.空载状态下的热分布试验第86页/共102页

2.每种装载方式下的热分布试验。不同装载方式对产品的热力学效果的影响.在产品容器内以及腔室内均匀放置测温探头以确定在装载状态下升温最缓慢的位置。此试验应在最大和最小装载方式下分别进行。

1)保温阶段的最高和最低温度(温度范围)及平均温度

2)最小和最大F0值

3)保温时间

3.复试验3次，以证明在该工艺条件下的温度均一性、重现性、并且与规定标准相符。探头放在产品外面，不与产品接触第87页/共102页(二)各种装载方式下的热穿透试验通过在产品容器内均匀分布测温探头以确定在灭菌时相应装载方式下的冷点。应分别在最大和最小装载方式下进行此试验，以确定不同装载方式对被灭菌物品的热力学效果的影响。通过实验应能获得如下数据:各点间的最高和最低温度(温度范围)保温阶段各点的平均温度各点的最小及最大F0值各点的保温时间。第88页/共102页通过热穿透试验应达到以下目的:1.测试数据应证明，在灭菌保温阶段整个腔室内各容器内的温差应不超过土l℃，各容器内温度之间的最大温差应不超过2℃。2.根据灭菌参数确定合适的产品灭菌程序。3.至少连续运行3次，以确保设定灭菌程序的稳定性和可靠性。对于大输液产品及高粘性的液体产品，必须对容器内的冷点进行测试。对旋转灭菌釜可以不用考虑容器内的冷点上中下第89页/共102页生物指示剂验证-过度杀灭工艺

选择与灭菌条件（工艺、对象及程序）相适应的生物指示剂（B.stearothermophilusATCC7953被视为标准菌株D121.1=1.5分，单位数量105–106个孢子）生物指示剂与温度探头并列在同一部位(10-20支)按规定条件培养生物指示剂，如嗜热脂肪芽孢杆菌的培养温度为55-60oC，培养7天，每天检查。对生物指示剂用培养基进行促生长检查进行阳性对照试验所有经受挑战试验的样品均呈阴性第90页/共102页生物指示剂验证–

非过度杀灭工艺选择与灭菌条件（工艺、对象及程序）相适应的生物指示剂生物指示剂的耐热性不得低于孢子在相应产品中的耐热性不得低于产品中污染菌的耐热性用于每次挑战试验的所有BI批号必须相同.生物指示剂的接种量计算

F0=D121.1×(logN0-logNt)第91页/共102页指示剂数量为20支左右。BI的D值是在被验证产品中的D值。与热穿透试验同时进行，放置在探头附近。结果能与热穿透保持一致。所有测试点均应确保SAL不低于6。重复三次。生物指示剂测试第92页/共102页再验证和变更管理再验证进行再验证的条件设备、产品、工艺有重大改变，或设备有重大维修定期的常规再验证（一次/12月）验证方法通常与初次PQ方案相同。变更管理有相关SOP来评价变更对工艺的潜在影响