动物源性食品中的抗生素检测概述

动物源性食品中的抗生素检测综述摘要：随着生产生活水平的提高，各种抗生素在动物源性食品生产过程中得到了广泛的应用，但由于抗生素本身的许多副作用，使得抗生素成为动物性食品安全的重要问题。本文则通过对一些广泛应用的抗生素的检测进行研究。Abstract：Withtheimprovementofproductionandlivingstandards,avarietyofantibioticsinfoodfromanimalhasbeenwidelyusedinitsproductionprocess,butbecausemanyofthesideeffectsoftheantibioticitself,theimportantissueofantibioticsinanimalfoodsafety.Thisstudyisbythedetectionofsomewidelyusedantibiotics.关键字：抗生素检测动物源性食品Keywords:antibioticdetectionanimaloriginfood正文抗生素是由微生物或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类磁极代谢物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。现临床常用的抗生素有微生物培养液液中提取物以及用化学方法合成或半合成的化合物。目前在动物源性食品中广泛应用的抗生素主要有氨基糖苷类抗生素、大环内酯类抗生素、B-内酰胺类抗生素等。一、前言氨基糖苷类抗生素,如链霉素、庆大霉素、新霉素、双氢链霉素等,对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有显著的抗菌效果,可以有效抑制细菌的生长和繁殖,因此是目前我国农业、畜牧业和水产业中常用的兽药之一,如用于防治鱼病、治疗细菌性烂鳃病、赤皮病、肠炎病、白嘴病等,也常添加到饲料中促进生长发育。该类抗生素的主要毒副作用体现为对于脑神经、听觉以及肾脏的损害,因此,针对该类药物在食品中的残留,许多国家和机构都规定了明确的最大残留限量(MRLS)。但是由于养殖过程中经常存在着违法使用或者不合理使用的现象,食品中氨基糖苷类抗生素的过量残留,已经成为国内外普遍关注的食品安全问题之一。实现氨基糖苷类药残的有效控制,首先要建立先进的检测方法和技术,并在此基础上构建合理、高效的检测体系。我国是动物源性食品的生产和出口大国,这方面的研究尤其具有重要的意义。氨基糖苷类抗生素的结构氨基糖苷是一种天然抗生素,品种多达200余类,其中有使用价值的品种不下30种,是由2个或多个氨基糖以糖苷键与氨基醇环结合的化合物。氨基糖苷类抗生素的检测方法氨基糖苷类抗生素没有特征的紫外吸收,因此微生物效价法是当前各国药典测定该类抗生素含量的主要方法。目前人们常利用CharmII试验快速检测和鉴定牛奶、肉、鸡蛋中的氨基糖苷类抗生素,牛奶中庆大霉素的检出限可以达到0102口g/ml,鱼和鸡蛋中链霉素的检出限可以达到0115口g/ml。黄晓蓉等采用阻抗分析法快速检测牛奶中氨基糖苷类抗生素残留，用嗜热乳酸链球菌作为指示菌，根据阻抗仪检测时间(DT)的产生,通过“阻抗分析仪”自动检测分析牛奶中氨基糖苷类抗生素的残留情况。方法操作简单、快捷,结果易判断,全部检测过程可在2h内完成。总的来说,基于微生物的检测方法所需设备简单、价格低廉,适合于大批样品的检测;但是该法存在菌种不易筛选,影响因素复杂、检测耗时长、稳定性差、精确度低、灵敏度低的特点,往往不能满足目前实际检测工作的要求。1.3免疫法免疫分析法是近年来快速发展的一种方法,具有灵敏度高、特异性强、适用范围广、操作简便、快捷、成本低廉及现场适应能力强等优点,已开始用于生物样本中微量抗生素的快速鉴别。根据对抗原标记方法不同,免疫分析法可分为放射免疫分析、酶免疫分析、荧光免疫分析、直接化学发光免疫分析等。放射性免疫法(RIA)是最先发展的免疫分析方法,并被用于液体中氨基糖苷类抗生素的测定，如秦燕等采用RIA检测鸡肝中链霉素残留，筛选水平为200口g/ml,对双氢链霉素的交叉反应率不到1%。但由于具有放射性污染，且后处理困难、费用高,RIA目前已较少应用。目前已经有一些新的免疫分析方法处于研究和发展之中。如荧光免疫分析(FIA)具有较高的灵敏度，而且容易实现自动化操作;化学发光免疫法的灵敏度一般高于其他同位素免疫测定方法;浊度免疫法的精密度较高,专属性较强;利用免疫组织化学技术可以研究药物在体内的分布状况,确定它对其他特殊细胞的损害作用,如氨基糖苷类抗生素的耳毒性副作用和对肾脏的损伤作用。1.4大型仪器测定法目前检测氨基糖苷类抗生素的大型仪器方法主要包括:气相色谱、液相色谱和毛细管电泳等,这些方法具有专属性强、灵敏度高的特点,已经成为测定食品中抗生素残留的重要方法。气相色谱(GC)氨基糖苷类抗生素为非挥发性化合物,且在紫外可见光区无吸收，须先进行衍生化，使其适于分析。HOEBUS等用六甲基二硅烷柱前衍生测定大观霉素,用填充柱气相色谱法,氢火焰离子化检测器检测，在75％~125％的浓度范围内，呈良好的线性，杂质的定量限为011%。1.4.2液相色谱(HPLC)检测氨基糖苷类抗生素大多采用反相色谱或离子对色谱系统。氨基糖苷类抗生素在低pH条件下为极性较强的碱性化合物,因此一般用强离子交换柱进行分离,这样可以进一步提高检测的精确度、稳定性和重复性。由于氨基糖苷类抗生素没有特征的紫外吸收,可以利用其结构中的活泼基团（如氨基、羰基）与衍生化试剂形成紫外区有吸收或有荧光的物质,以便于紫外检测或荧光检测,其中又可分为柱前衍生和柱后衍生2种衍生化方法。1.4.3毛细管电泳（CE）毛细管电泳是20世纪80年代后期发展起来的一种分离分析技术,具有分离效率高、速度快、样品用量少的特点。其中毛细管区带电泳和胶束电动毛细管色谱处理样品量少,效率高,可以应用于生物样品的分析。FLURER和PHARM利用毛细管区带电泳直接用紫外检测法测定了12种氨基糖苷类抗生素及其杂质（庆大霉素、链霉素、双氢链霉素、卡那霉素等）,方法有良好的精密度（RSD=3%），定量限在50口g/ml。但是总体来看目前采用CE检测氨基糖苷类抗生素的报道很少,这主要是因为采用传统的分光光度法检测的灵敏度很低。5发展前景及趋势对于食品中农兽药残留，以HPLC为代表的色谱技术已经被证明为最为有效的确证性检测手段之一。针对氨基糖苷类抗生素,伴随着新型检测器的出现和应用,如电化学检测器、示差折光检测器、脉冲电化学检测器、蒸发光散射检测器（ELSD）等,非衍生化HPLC方法的开发具有非常大的发展潜力和实用价值。目前及今后较长一段时间,免疫分析方法仍然是食品中氨基糖苷类抗生素残留首选的快速检测方法。随着单克隆抗体、生物传感器和胶体金等相关技术的发展和完善,在进一步强化其原有简便、快速、灵敏等优点的基础上,准确度和精密度的提高将成为重要的研究和开发目标,使其不仅适合于生产和流通过程中针对大量样本进行快速筛选检测,而且在一定条件下具备部分快速确证性检测的功能,从而与色谱检测技术有机结合后,构建起合理、高效的检测体系二大环内酯类抗生素MALs大环内酯类抗生素是由放线杆菌或小单孢菌产生的一类抗生素。近年来。该类药物被广泛应用于畜禽、水产养殖业中。已成为全世界需求量和销售速度增长最快的抗生素之一。由于MALs具有广谱抗菌作用，可抵抗革兰氏阳性菌、支原体菌属和部分革兰氏阴性菌，因此被广泛应用于治疗猪、牛、羊、虾及家禽的呼吸性和肠道传染性疾病，或作为饲料添加剂促进动物生长发育。目前已在多种机体如猪、牛、禽类组织、鱼组织、奶和蛋中检测到MALs的残留。长期食用残留该类药物的食品，可能造成人体肠道细菌菌群失调。MALs残留检测方法2.1生物学方法2.1.1微生物效价法生物效价法是经典的大环内酯类抗生素含量测定方法。这种筛选方法简便、快速、易操作、灵敏度高，但由于该方法固有的局限性（如菌种的差别等），结果可比性差，方法的检测限低，达不到准确定性定量分析的目的。2.1.2放射受体分析法（RRA）RRA是基于受体与配体的特异性结合的分析方法，其竞争结合原理与放射免疫分析相似。应用受体的这种特异性可以实现对某一类抗生素的多残留分析。目前该方法是我国检测肉类组织、内脏和水产品中MAL残留的一个现行标准方法之一。2.2化学方法2.2.1薄层色谱法TLC是20世纪50年代发展起来的一种色谱技术，具有操作简单、应用性广、灵敏度高、快速和检验成本低的特点，特别适用于无紫外吸收的杂质的检测。我国2000版的《中国药典》中也使用该方法作为大环内酯类抗生素物质的检测方法。不过，该方法的分离能力较差，检测灵敏度较低。毛细管电泳法CE是20世纪80年代中后期迅速发展起来的一类以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力的新型液相分离分析技术，具有高效、样品及耗溶剂少、成本低。分析快速等优点。该方法也逐渐应用于MAL的分析当中。此法的缺点是检测灵敏度不够高，需结合电化学或电化学发光技术才能实现其高灵敏度检测。2.2.3液相色谱(LC-DAD或荧光法)由于MALs具有发光团。多数具有较强的UV吸收。因此可用紫外检测器(UV)包括二极管阵列检测器(DAD)对其进行检测。目前该方法已成为大多数实验室MALs残留检测的常用方法。2.2.4液质联用法(LC—MS/LC—MS/MS法)液相色谱-质谱联用是将应用范围极广的液相色谱分离方法与灵敏、专属、能提供分子量和结构信息的质谱法结合起来的一门新技术.在国内。LC—MS,MS现被应用于禽畜肉［ml、蜂蜜和蜂王浆等MALs多残留同时检测当中。LC—MS/MS法现在是我国动物源性食品中MALs检测的国家标准方法。三B-内酰胺类牛乳中B-内酰胺类抗生素残留的原因牛乳中抗生素残留有三大方面原因:治疗目的用药、非治疗目的用药和非法人为污染。具有B-内酰胺环类的抗生素由于其廉价广谱的抗菌性而被广泛且频繁地超剂量使用，因此导致牛乳中高浓度的B-内酰胺类抗生素残留。青霉素类抗生素是一类重要的B一内酰胺类抗生素，也是使用最广泛的治疗牛乳腺炎和其它乳牛疾病的抗生素，乳牛用药后，青霉素将不可避免的移行到最初几天的乳汁中，这一现象称之为青霉素残留。B-内酰胺类抗生素在牛乳中的残留危害过敏反应若含B-内酰胺类抗生素的牛乳被敏感人群饮用，可引起食用者过敏反应，表现症状轻则皮疹、发热、关节疼痛及胃肠道紊乱引起腹泻、恶心和呕吐等症状，严重时可发生过敏性休克，甚至危及生命。1.2增强细菌耐药性美国、德国等国学者也表明:在乳中含有耐药菌株，耐药基因通过质粒转移传染给敏感菌株使其获得耐药性。耐药基因的转移可在人体内进行，并可在人群、细菌、动物群等生态系统中的细菌间互相传递，当人体发生疾病时，可增加人类和动物感染性疾病治疗的难度，导致治疗失败，形成恶性循环。破坏胃肠道菌群失调在正常条件下健康人与动物胃肠道内寄生大量菌群，这些菌群与人体能相互适应，抗生素残留会抑制甚至杀死人体肠道内正常敏感菌群的生长，引起服用者体内致病菌、条件致病菌大量繁殖，破坏人体肠道菌群平衡。3.2检测方法最常用的检测方式为浓度型的紫外检测器和荧光检测器。紫外检测器(UVD)最普及，其次是荧光检测器和电化学检测器(ECHD)。3.2.1气相色谱法(GC)气相色谱有许多高灵敏、通用性或专一性强的检测器供选用，如氢火焰离子化检测器(FID)电子捕获检测器(ECD)、氮磷检测器(NPD)等，检测限一般为ppb级，但大多数兽药极性或沸点偏高，需繁琐的衍生化步骤，限制了GC的应用3.2.2薄层色谱法(TLC)TLC经常作为样品筛选方法，其优点是速度快，可以同时在多快板上点样，处理大批样品的时间短，溶剂用量少，不需要复杂的仪器也可以开展试验，有利于现场应用，但仍需要复杂的样品前处理，灵感度不高，不易定量，重现性不好。联用技术联用技术可扬长避短，一般兼分离、定量和定性(分子结构信息)于一体，因而特别适用于确证性分析。常见的联用技术有薄层色谱-质谱(TLC-MS)、气相色谱-质谱(GC-MS)、液相色谱-质谱(LC-MS)、毛细管区域电泳-质谱(CZE-MS)、液相色谱-核磁共振(LC-NMR)、超临界流体色谱-质谱(SFC-MS)等。其它理化检测方法奶中青霉素残留检测方法还有超临界流体色谱(SFC)和毛细管区域电泳法(CZE)等，这些方法尽管在残留检测中不常用，但因其各自特有的性能，能弥补常用方法中不足之处。如CZE是90年代以来研究最活跃的分析技术之一，兼有高压电泳的高速、高分辨和HPLC灵活、高效的优点。免疫分析法。的基本原理是以抗原或半抗原和抗体特异性结合为抗原一抗体复合物的免疫反应为基础的生化测试技术。免疫分析法主要有放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)、荧光免疫分析(FIA)和酶联免疫吸附法(ELISA)。ELISA试剂盒是目前奶牛场和牛奶公司使用最广泛、快速、灵敏的检测青霉素类抗生素残留的方法。各类抗生素试剂盒均为国外生产，这使得国内的奶及奶制品公司花费较大，如国外公司生产的抗生素检测试剂盒，一个96次检测剂盒要花三、四千元。因此很有必要研制和开发出国产的试剂盒，以降低成本，提高经济效益。四结束语抗生素残留问题已成为公认的“食品安全隐患”问题，然而动物原料及制品是否真正“无抗”则需经得起检验，微生物检测法经济简便，可定性检测，但检测时间长，多用于初级筛选;理化检测法检测精度高，可定量检测，但检测前处理复杂，需要大型昂贵仪器，多用于残留分析的确证;免疫法虽然速度快、特异性强但因受到成本、广谱性、操作难易程度等多因素影响很难在我国推广。可见，研制出经济省时、简便易行、灵敏度高、检测限低的牛乳中抗生素残留检测方法已成为迫切的课题。五参考文献李明远．微生物学与免疫学．人民卫生出版社，2001．邓斌等．牛奶中抗生素残留及其检测分析研究进展饲料广角．2002，24.李明远．微生物学与免疫学．人民卫生出版社，2001．HolstegeDM,PuschnerB,WhiteheadG，GaleyFD,Screeningandmassspectralconfirmationofbeta—lactamantibioticresiduesinmilkusingLC／MS,Journalofagriculturalandfoodchemistry50(2：)406—411JAN162002TANAKAN,HOOPERIR.Aminoglycosideantibiotics[M].Ber2lin:Springer2Verlag,1982:221.王春奕.鸡和鸡蛋中抗菌素残留的检测[J].中国家禽,1997,11(3):16-17.吴燕,郭成明,袁雯玮.氨基糖苷类抗生素分析方法进展[J].天津药学,2005,17(1):46-48.王敏，郭德华顾鸣。等．动物源性食品中大环内酯类药物残留的快速筛选方法J]中国卫生检验杂志，2007,17(3)：400—406.于慧娟。沈小盛，李庆．高效液相色谱法一荧光法测定对虾组织中红霉素的残留量[J].分析实验室，2006,25(4):82-85.林敬平.国内孚L品抗生素残留值得重姻〕.当代畜禽养殖业2。5(3):1.IvetaKukurova,BeanadetaHozova.InteractionsofAntimicrobialsinMilkandTheirDetetionbytheDiffusionMethodandDelvotestSP.JournalofA0ACInternational.2003,