双向电泳详细操作过程

本文格式为Word版，下载可任意编辑——双向电泳详细操作过程蛋白质的双向电泳

一、试验原理：

2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分开，其次向SDS是基于蛋白质分子量不同，而将一向分开后的蛋白进一步分开。这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。二、试验步骤：

1.芽孢杆菌蛋白质的提取

2.蛋白质样品的纯化

将经过硫酸铵沉淀的蛋白质冷冻枯燥，放在-80度冰箱里备用，取出蛋白质干粉300mg加水化液(尿素水化储存溶液)400ul，加丙酮酸（加DTT）1.6ml，放置-20度冰箱2h，离心，吸除丙酮酸，用超纯水中（加DTT），清洗两次，离心，加水化液溶解。水化液配置：用ddH20定容

水化液尿素（60.06）

硫脲（76.12）CHAPSDTT(154.2)

浓度7M/L2M/L4%1%

100ml42.0g15.2g4g1g

20ml8.4g3.04g0.8g0.2g

（注：DTT现用现加）

3.Bradford法测蛋白含量

取0.001gBSA（牛血清白蛋白）用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序参与0ul,20ul,40ul,60ul,80ul,100ul的BSA溶解液，在分别参与100ul,80ul,60ul,40ul,20ul,0ul,分别参与4ml的Bradfor。另取2管中分别参与2ul的待测样品溶液，各管中分别参与4ml的Bradfor，摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值。(测量过程要在一个小时内完成)。例如：

标准曲线方程式：Y=aX+b.其中Y为OD值，X为蛋白含量。a、b通过作图输入数

据可知

G250的配置：称取G250固体0.1g加水定容至1L。使用前滤纸过滤。

比色皿用70%的乙醇保存，待用时用双蒸水冲洗，再用无水乙醇冲洗，双蒸水冲洗，再参与待测样品溶液润洗，然后，参与样品，测定OD值。

表-1五种蛋白质测定方法的比较

方法凯氏定氮法（Kjedahl法）双缩脲法（Biuret法）Folin-酚试剂法（Lowry法）考马斯亮蓝法(Bradford法)紫外吸收法50～100μg1～5μg考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时其λmax由465nm变为595nm蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收

各种嘌呤和嘧啶，各种核苷酸强碱性缓冲液，TritonX-100,SDS5μg磷钼酸-磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原硫酸铵，Tris缓冲液，甘氨酸，各种硫醇1～20mg灵敏度0.2～1.0mg原理将蛋白质转换为氮，用酸吸收后滴定多肽键加碱性铜离子生成紫色络合物干扰物质非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分开）硫酸铵，Tris缓冲液和某些氨基酸3.双向电泳第一向IEF（双向电泳中一律使用超纯水,16-18个小时）

3.蛋白质的水化

蛋白质的上样浓度，选用胶条长度17cm，PH3-10：蛋白质上样量为600ug/300ml,最终体积为300ml，蛋白质含量为600ug。

若测得蛋白质量：B为12ug/ul(600/12=50)，按每管50ul分装，加250ul水化液体，最终体积300ul（体积300ul，蛋白质含量600ug）。

IPG胶条蛋白质载样量（考马氏亮蓝R-250）

胶条长度7cm11cm17cm

4.取出-20℃冷冻保存的IPG预制胶条（17cmpH3-10），室温中放置30分钟。而后，用镊子去除IPG胶条上的保护层。

5.加样：沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性参与样品。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡。分两次吸取样品，每次300ul,按从正极到负极的顺序参与点样槽一侧(17cm，pH3—8，蛋白质上样量600ug/300ul)胶条。

加样体积125ul185ul300ul样品蛋白量169ug250ug405ug

6．将IPG胶条胶面朝下置于样品溶液上，胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极并与电极紧凑接触，不使胶条下面的溶液产生气泡，使水化液浸湿整个胶条，10分钟。

7.在每根胶条上覆盖1-3ml矿物油(根据不同胶条长度,本试验2ml)，防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的参与矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴渐渐加在塑料支撑膜上，盖上盖子放置在室温，14小时。（用水平仪调整胶曹的水平）

8．上胶：取出过夜的胶条，正面向上放置在用超纯水润湿的滤纸上吸除矿物油。取滤纸桥用超纯水润湿，放置在IEF的正负两级上。从正极到负极将胶条压入槽中，同时参与矿物油，注意把气泡赶出，盖上盖子。17cm聚焦盘

9.对好正、负极，盖上盖子。将聚焦槽水平放入等电聚焦仪中，设置等电聚焦程序。其中S1用于泡胀水化胶条，S2和S3用于去小离子，S4和S5用于聚焦（16-18小时）

温度

最大电流

胶条水化体积电压

S1(50v,slow，慢速溶胀)S2(250v,line,线性除盐)S3(1000v,rapid,快速除盐)S4(9000v,line,线性升压)S5(9000v,rapid,快速聚焦)S6（500v,rapid快速保持）

选择所放置的胶条数。

设置每根胶条的极限电流。（50?A/根）设置等电聚焦时的温度。（20℃）

IPG运行条件(17cm胶条)

20℃

50uAperIPGstrip300(17cmIPGstrip)时间10min30min50mine4.50h65000vh任意时间

高通量聚焦槽

10.IEF主机通电检查，如屏幕显示如下，则为正常

BIO-RADLABORATORIESPROTEANIEFCELLFIRMWAREVERSION1.40SYSTEMINITIALIZATION

之后，屏幕会显示如下REHYDRATION>PRESETMETHOD>STOREDMETHOD>NEWMETHOD>

IPG胶条所需水化液体积

胶条长度(cm)

每条需水化液体体积(ul)

不同胶条长度胶条等电聚焦程序设置：

7cm胶条

水化12小时（18℃）主动水化（50V）或被动水化

S1S2S3S4S5

250V500V4000V4000V500V

线性快速线性快速快速

30分钟30分钟3小时

除盐除盐升压聚焦保持

7125

11200

13250

18350

24450

20,000伏小时任意时间

选择所放置的胶条数。

设置每根胶条的极限电流。（50?A/根）设置等电聚焦时的温度。（20℃）11cm胶条

水化12小时（20℃）主动水化（50V）或被动水化

S1S2S3S4S5

250V1000V8000V8000V500V

线性快速线性快速快速

30分钟除盐除盐升压聚焦保持

30分钟4小时40,000伏小时任意时间

选择所放置的胶条数。

设置每根胶条的极限电流。（50?A/根）

设置等电聚焦时的温度。（17℃）

17cm胶条

水化12小时（20℃）S1S2S3S4

250V1000V

主动水化（50V）或被动水化

30分钟1小时

除盐除盐升压聚焦保持

线性快速线性快速

10000V10000V5小时60,000伏小时任意时间

S5500V快速选择所放置的胶条数。

设置等电聚焦时的温度。（20℃）

4.双向电泳其次向SDS.1配制12.5%的丙烯酰胺凝胶两块

设置每根胶条的极限电流。（50?A/根）

配胶：（最有胶液的总体积200ml）(10%SDS3ml称取0.3g10%APS3ml称取0.3g)(1).ddH2062.7ml

(2).30%Acr/Bis83.3ml（购买）

(3).1.5mol/LTris—HClPH=8.850ml（购买）(4).10%SDS2ml配置(5).10%APS2ml配置

(6).TEMED（购买）35-40ul

（注：10%APS和TEMED最终在灌胶前加，参与后在搅拌时尽量减少气泡）4.2灌胶（注意短板的摆放）

将玻璃板洗净后，室温晾干。然后,将电泳槽平衡好，在两块胶之间放夹层，最终的盖板用钳子拧紧，以免漏胶。将将配好的胶倒入注入玻璃板夹层中，上部留约1cm的空间超纯水封面，保持胶面平整胶曹（3ml左右ddH20压胶，注意不要有气泡产生）。将做好的胶用保鲜膜盖住，胶放置4小时。

表1配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分开胶所用溶液

不同体积（ml）凝胶液中各成分所需体积（ml）

溶液成分

6%水

30%丙烯酰胺溶液1.5mol/LTris(pH8.8)10%SDS10%过硫酸氨TEMED8%水

30%丙烯酰胺溶液1.5mol/LTris(pH8.8)10%SDS10%过硫酸氨TEMED10%水

30%丙烯酰胺溶液1.5mol/LTris(pH8.8)10%SDS10%过硫酸氨TEMED12%水

30%丙烯酰胺溶液1.5mol/LTris(pH8.8)10%SDS10%过硫酸氨TEMED15%水

30%丙烯酰胺溶液1.5mol/LTris(pH8.8)10%SDS10%过硫酸氨TEMED

52.611.30.050.050.0042.31.31.30.050.050.0031.91.71.30.050.050.0021.621.30.050.050.0021.12.51.30.050.050.002

105.322.50.10.10.0084.62.72.50.10.10.00643.32.50.10.10.0043.342.50.10.10.0042.352.50.10.10.004

157.933.80.150.150.0126.943.80.150.150.0095.953.80.150.150.0064.963.80.150.150.0063.47.53.80.150.150.006

2010.6450.20.20.0169.35.350.20.20.0127.96.750.20.20.0086.6850.20.20.0084.61050.20.20.008

2513.256.30.250.250.0211.56.76.30.250.250.0159.98.36.30.250.250.018.2106.30.250.250.015.712.56.30.250.250.01

3015.967.50.30.30.02413.987.50.30.30.01811.9107.50.30.30.0129.9127.50.30.30.0126.9157.50.30.30.012

4021.28100.40.40.03218.510.7100.40.40.02415.913.3100.40.40.01613.216100.40.40.0169.220100.40.40.016

5026.51012.50.50.50.0423.213.312.50.50.50.0319.816.712.50.50.50.0216.52012.50.50.50.0211.52512.50.50.50.02

1.1配制12.5%的丙烯酰胺凝胶：

配胶：（最有胶液的总体积200ml）(10%SDS3ml称取0.3g10%APS3ml称取0.3g)(1).ddH2062.7ml

(2).30%Acr/Bis83.3ml（购买）

(3).1.5mol/LTris—HClPH=8.850ml（购买）(4).10%SDS2ml配置(5).10%APS2ml配置

(6).TEMED（购买）35-40ul{(5)和(6)使胶凝固｝

（注：10%APS和TEMED最终在灌胶前加，参与后在搅拌时尽量减少气泡）

1.2电泳液配置：（4L）

甘氨酸

SDS

Tris

57.6g4g12.12g

ddH20

定容4L

2.灌胶：将玻璃板洗净后，室温晾干，然后，将电泳槽平衡好，玻璃板夹好，再在玻璃板底部涂上凡士林以防漏胶，盖板用钳子拧紧，以免漏胶。将配好的胶倒入注入玻璃板夹层中，上部留约1cm的空间超纯水封面，保持胶面平整胶曹（3ml左右ddH20压胶，注意不要有气泡产生），做好的胶用保鲜膜盖住，胶放置4小时。3.平衡液配制（减少电内渗，使被分开的蛋白质与SDS完整结合）

平衡液

尿素1.5mol/LTris-HCl

甘油

SDS溴酚蓝ddH20

浓度6M1.5M30%2%0.002%加至10ml

100ml36.04g3.34ml30ml2g200ul100ml管分装

50ml18.02g1.67ml15ml1g100ul50ml-20°C

4.配制胶条平衡缓冲液I。｛10ml平衡液储液中加DTT0.1g。（2根胶条）｝

加DTT使变性的非烷基化蛋白处于还原状态

5．在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚

滤纸用超纯水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。

6.将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，在有胶条的槽中参与5ml胶条平衡缓

冲液I。将样品水化盘放在水平摇床上缓慢晃动15分钟。

胶条的长度胶条平衡缓冲液I胶条平衡缓冲液II7cm2.5ml2.5ml11cm4ml4ml17cm6ml6ml18cm6ml6ml24cm8ml8ml7.配制胶条平衡缓冲液II。｛10ml平衡液储液中参与碘乙酰胺0.5g。（2根胶条）｝

加碘乙酰胺使蛋白质巯烷基化，防止其在电泳过程中重新氧化

8.第一次平衡终止后，完全倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。并用滤纸

吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。再参与胶条平衡缓冲液II，继续在水平摇床上缓慢晃动15分钟。

9.用滤纸吸去SDS聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将处理好的其次

向凝胶放在桌面上，长玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着自己。10.将琼脂糖封胶液进行加热溶解。

11.将10×电泳缓冲液，用量筒稀释10倍，成1×电