等电点电泳 原理 步骤 详细

讲课内容

IEFE定义

1

IEFE的特点

2

IEFE的基本原理3

IEFE的应用4

血红蛋白的等电聚焦电泳（实验）

5上海交通大学医学院现在是1页\一共有43页\编辑于星期一一、IEFE定义

IEFE一种利用具有pH梯度的支持介质分离等电点（isoelectricpoint，pI)不同的蛋白质的电泳技术。

Isoelectricfocusing(IEF),isatechniqueforseparatingdifferentmoleculesbytheirelectricchargedifferences.上海交通大学医学院现在是2页\一共有43页\编辑于星期一

等电聚焦(Isoelectricfocusing,IEF)就是在电泳介质中放入载体两性电解质(Carrierampholyte)，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，在此体系中，不同的蛋白质即移动到或聚焦于其相当的等电点位置上，也就是说被聚焦于一个狭的区带中，电泳技术中的等电点聚焦也称为聚焦电泳。

上海交通大学医学院现在是3页\一共有43页\编辑于星期一讲课内容

IEFE定义

1

IEFE的特点

2

IEFE的基本原理3

IEFE的应用4

血红蛋白的等电聚焦电泳（实验）

5上海交通大学医学院现在是4页\一共有43页\编辑于星期一二、IEFE的特点

（一）优点HighResolutionHighSensitivity

GoodReproduction上海交通大学医学院现在是5页\一共有43页\编辑于星期一（二）缺点1.要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀。2.样品中的成分必须停留在其pI，不适用在pI不溶或发生变性的蛋白质。上海交通大学医学院现在是6页\一共有43页\编辑于星期一分辨率(resolution)较不连续PAGE更高，特别适合于分离分子量(molecuarweight,MW)相同而电荷(electriccharge)不同的生物大分子。

QM=——6r上海交通大学医学院现在是7页\一共有43页\编辑于星期一讲课内容

IEFE定义

1

IEFE的特点

2

IEFE的基本原理3

IEFE的应用4

血红蛋白的等电聚焦电泳（实验）

5上海交通大学医学院现在是8页\一共有43页\编辑于星期一三、IEFE的基本原理上海交通大学医学院现在是9页\一共有43页\编辑于星期一蛋白质分子在不同pH下的解离状态

NH3+NH3+NH2PPPCOOHCOO-COO-

pH＜pIpH＝pIpH＞pI

上海交通大学医学院现在是10页\一共有43页\编辑于星期一

在电泳介质中放入载体两性电解质(carrierampholytes)

，当通入直流电时，两性电解质形成一个由正极(anode)到负极(cathode)逐渐增加的pH梯度，正极附近是低pH区，负极附近是高pH区。上海交通大学医学院现在是11页\一共有43页\编辑于星期一蛋白质分子的电聚焦过程

+pI1

pI2

pH=pIpI3

pIn-

abc

蛋白质分子在负极端蛋白质分子在正极端蛋白质样品中各组分聚焦成区带

—+上海交通大学医学院现在是12页\一共有43页\编辑于星期一

在这个从正极到负极pH逐渐增加的直流电场中，当蛋白质进入这个环境，不同的蛋白质带上不同性质和数量的电荷，向着一定方向移动，迁移到与其相同的等电点位置上停留下来，即被聚焦于一个狭的区带中，得以分离。TheproteinsbecomefocusedintosharpstationarybandswitheachproteinpositionedatapointinthepHgradientcorrespondingtoitspI.

上海交通大学医学院现在是13页\一共有43页\编辑于星期一上海交通大学医学院现在是14页\一共有43页\编辑于星期一进行IEFE必须具备3个条件：①有一个在电泳条件下基本稳定、重复性良好的pH梯度②有一个抗对流的电泳材料，使已经分离的样品不再重新混合③电泳后有适当的方法来鉴定分离的区带上海交通大学医学院现在是15页\一共有43页\编辑于星期一（一）pH梯度的建立

用多种两性电解质(ampholytes)混合物建立稳定良好的pH梯度上海交通大学医学院现在是16页\一共有43页\编辑于星期一1.理想的载体两性电解质（Carrierampholytes）应具备的特征：

①分子量要小，以便与被分离大分子物质分离；②化学性质稳定；③各成分的pI彼此接近，并在其pI值附近有良好的缓冲能力；④在pI处具有足够的电导，导电性均匀；⑤两性电解质载体的数目要足够多；⑥可溶性好；⑦对280nm的紫外光没有或仅有很低的吸光度，不干扰样品的测定。上海交通大学医学院现在是17页\一共有43页\编辑于星期一2.载体两性电解质的合成

本质：一系列脂肪族(aliphaticampholytes)多氨基多羧酸同系物和异构体，具有很多既不相同又十分接近相互连接的pI值。pH范围：pH3~10丙烯酸+多乙烯多胺

Ampholine（LKB）加成反应上海交通大学医学院现在是18页\一共有43页\编辑于星期一上海交通大学医学院现在是19页\一共有43页\编辑于星期一3.pH梯度的形成

载体两性电解质(Carrierampholytes)是一系列不同分子的两性电解质的混合物,在通电后，它们各自迁移到适当位置形成一个连续的pH梯度(pHgradient)。

上海交通大学医学院现在是20页\一共有43页\编辑于星期一

㈠没通电时的变化所有的载体两性电解质(Carrierampholytes)分子都荷电，只是溶液中荷正电和荷负电的基团数目相等，净电荷(netcharge)为零。上海交通大学医学院现在是21页\一共有43页\编辑于星期一㈡引入电场时的变化载体两性电解质(carrierampholytes)分子将向阴极(cathode)或阳极(anode)迁移，带有最低等电点的分子（荷最多的负电）将最快地向阳极迁移。当它达到净电荷是零的位置时才停止。其次一些低pI的载体两性电解质分子（荷其次多的负电）也将向阳极移动，直到它的净电荷被减少到零才停止。上海交通大学医学院现在是22页\一共有43页\编辑于星期一㈢电泳结束后的变化

所有的载体两性电解质(carrierampholytes)分子以增加pI级数的办法将分别在阳、阴极之间到达它们自己的位置而给出一个pI梯度。上海交通大学医学院现在是23页\一共有43页\编辑于星期一上海交通大学医学院现在是24页\一共有43页\编辑于星期一电解槽中，通电后，正负两极都会发生电极反应：正极端反应：6H2O→O2+4H3O++4e-负极端反应：4H2O+4e-→2H2+4OH-在负极引起pH值的升高，在正极pH下降，另外在电极槽的正极端放的是酸性溶液，负极端放的是碱性溶液造成了在电极附近pH的急剧变化上海交通大学医学院现在是25页\一共有43页\编辑于星期一

由于载体两性电解质(carrierampholytes)是一系列不同分子的两性电解质的混合物所组成的，设其中某一成分为A，它的pI=pH’，当环境中的pH>pH’时，它带负电荷，朝正极移动。上海交通大学医学院现在是26页\一共有43页\编辑于星期一当环境pH<pH’时，它带正电荷，朝负极移动，直至移动到它的等电点处，在那里聚集。由于两性电解质A在它的pI处具有一定的缓冲能力，因此在它附近形成一个pH稳定区域。上海交通大学医学院现在是27页\一共有43页\编辑于星期一

同样载体两性电解质(carrierampholytes)中各种两性电解质也会各自迁移到它们的等电点(isoelectricpoint,pI)处，由于它们的数量足够多，各自的等电点相差很小，从而形成一个pH梯度。上海交通大学医学院现在是28页\一共有43页\编辑于星期一上海交通大学医学院现在是29页\一共有43页\编辑于星期一上海交通大学医学院现在是30页\一共有43页\编辑于星期一（二）支持介质(medium)的选择

作用：防止扩散抗对流liquidmedium：蔗糖、Ficollgelmedium：agarose、sephadex、PAG上海交通大学医学院现在是31页\一共有43页\编辑于星期一（三）聚焦后的检测方法各种染色法扫描与定量其它检测方法上海交通大学医学院现在是32页\一共有43页\编辑于星期一讲课内容

IEFE定义

1

IEFE的特点

2

IEFE的基本原理3

IEFE的应用4

血红蛋白的等电聚焦电泳（实验）

5上海交通大学医学院现在是33页\一共有43页\编辑于星期一四、IEFE的应用

ApplicationsofIEF1.分析分离制备蛋白质、多肽①区分人血清蛋白②测出异常免疫球蛋白③基因分型④csf中寡克隆区带的检测2.测定pI可鉴定蛋白质、多肽3.双相电泳中，IEF作为第一相上海交通大学医学院现在是34页\一共有43页\编辑于星期一双向电泳（two-dimensionalelectrophoresis,2-DE）上海交通大学医学院现在是35页\一共有43页\编辑于星期一考马斯亮蓝银染上海交通大学医学院现在是36页\一共有43页\编辑于星期一讲课内容

IEFE定义

1

IEFE的特点

2

IEFE的基本原理3

IEFE的应用4

血红蛋白的等电聚焦电泳（实验）

5上海交通大学医学院现在是37页\一共有43页\编辑于星期一实验血红蛋白的等电聚焦电泳Hb具有四条多肽链

（α、β、γ、δ）

上海交通大学医学院现在是38页\一共有43页\编辑于星期一HbA正常成人血中主要的Hb成分。HbA2

正常成人Hb中的一个次要成分，当

胎儿出生时，其浓度不到1%，以后

稍增多，在正常成人中其平均值自

2.2%至2.6%左右，最高范围一般

不超过3.5%。

上海交通大学医学院现在是39页\一共有43页\编辑于星期一HbF1866年发现，是胎儿和初生儿的Hb的主要成分，足月的初生婴儿血中大约有70-80%为HbF，其余为HbA。婴儿出生后不久，HbF的浓度迅速减少，同时HbA相应增多，绝大多数正常人于出