第八章PCR技术及其应用

第八章PCR技术及其应用第1页，共100页，2023年，2月20日，星期一前言PCR技术简史链式反应：chainreaction燃烧中的链式反应：有焰燃烧都存在链式反应。可燃物受热时不仅会汽化，而且分子会发生热裂解作用，产生高度活泼的、易与其他自由基和分子反应的自由基，使燃烧持续进行下去。核链式反应：指能自持进行的原子核反应。如铀-235核受到中子轰击后分裂成两块，同时放出二至三个次级中子和一定能量。除去损耗以后，这些次级中子中如能至少剩下一个以引起另一个铀-235核裂变，则裂变反应就可继续下去，这样的链式反应是自持的。原子弹与核反应堆是根据这一原理而设计的。第2页，共100页，2023年，2月20日，星期一第3页，共100页，2023年，2月20日，星期一DNA的复制聚合酶链反应的发明PCR：polymerasechainreaction，聚合酶链式反应。1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……第4页，共100页，2023年，2月20日，星期一ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长第5页，共100页，2023年，2月20日，星期一ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5’AUCGCG5’引物酶引物酶第6页，共100页，2023年，2月20日，星期一ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5’AUCGCG5’TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶第7页，共100页，2023年，2月20日，星期一1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E.coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪第8页，共100页，2023年，2月20日，星期一KaryB.Mullis

<<TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction>>1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。第9页，共100页，2023年，2月20日，星期一引物引物Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段第10页，共100页，2023年，2月20日，星期一Taq

DNA聚合酶（Thermusaquaticus)酶活性(%)温度(℃)40506070809010010080604020第11页，共100页，2023年，2月20日，星期一72℃94℃55℃PCR循环第12页，共100页，2023年，2月20日，星期一一、PCR的基本原理类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。第一节PCR技术原理和工作方式第13页，共100页，2023年，2月20日，星期一第14页，共100页，2023年，2月20日，星期一DenaturetemplateDNAbyheat(95oC)TargetSequenceTargetSequence①模板DNA的变性：模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；PCRCycle-Step1–第15页，共100页，2023年，2月20日，星期一PCRCycle-Step2–

Temperatureislowered(Tm)andprimersannealtotargetsequencesTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；第16页，共100页，2023年，2月20日，星期一PCRCycle-Step3-

At72oCTaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionascomplementarynucleotidesareincorporatedTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTPs为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链。第17页，共100页，2023年，2月20日，星期一Endofthe1stPCRCycle–

ResultsintwocopiesoftargetsequenceTargetSequenceTargetSequence每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。第18页，共100页，2023年，2月20日，星期一TargetAmplificationNo.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon第19页，共100页，2023年，2月20日，星期一1

缓冲液10mmol/LTris-HCl，50mmol/LKCl，pH=8.3-9.0(室温时约为7.2)，还可能有添加剂、共溶剂等。厂商一般以10倍的贮存液形式提供。Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。厂商一般以25mmolMgCl2+形式提供，使用浓度为0.5mmol/L至2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTPs、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。二、PCR反应体系第20页，共100页，2023年，2月20日，星期一2、脱氧三磷酸核苷(dNTPs)

dATP、dGTP、dCTP、dTTP四种的等量混合物。厂商一般提供为10mmol/L或4mmol/L的贮存液，使用浓度为0.2mmol/L左右。

dNTPs浓度取决于扩增片段的长度。

浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量。

dNTPs可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。第21页，共100页，2023年，2月20日，星期一PCR引物的设计一般原则1.引物长度一般以18～30bp为宜，过短则降低特异性，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增，同时也增加引物合成的成本。2.解链温度(Tm值)很重要，直接决定了扩增中可使用的退火温度(Ta值)的高低，较高时特异性增加，但退火效率下降，过低时退火效率较高，但特异性下降。两条引物间的Tm值越接近越好。计算Tm值的方法很多，简易公式为Tm=4×(G+C)+2×(A+T)，适于短于20nt的引物。长引物的Tm值计算公式见书，但比实际值往往偏低。精确的Tm计算需要考虑缓冲液的盐离子浓度和引物内部的相邻碱基的动力学参数。3、引物

一般溶成10mol/L的贮存液，使用浓度为1-5mol/L。

浓度过低则产量低，过高则易导致错配，PCR特异性下降。第22页，共100页，2023年，2月20日，星期一3.避免引物内部出现二级结构，避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。4.要避免两个引物间特别是3’末端碱基序列互补以及同一引物自身3’末端碱基序列互补的，使它们不能形成引物二聚体或发夹结构。5.G/C和A/T碱基均匀分布，G+C含量在40～60%之间，引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶连续排列。6.引物3’末端碱基一般应与模板DNA严格配对，并且3’末端为G、C或T时引发效率较高，但3’要避免较密的C+C或G+C连排。7.引物5’末端碱基可不与模板DNA匹配，可添加与模板无关的序列(如限制性核酸内切酶的识别序列、ATG起始密码子或启动子序列等)，便于克隆和表达，但其保护碱基有一定的要求。8.引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。第23页，共100页，2023年，2月20日，星期一4、模板单、双链DNA均可。一个PCR反应中104至107个模板分子可获得较理想的效果，但由于PCR较灵敏，更少的模板分子数在循环数增加时也会得到大量扩增。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类，模板纯度不高往往是限制PCR扩增的重要因素。

不同属性的模板所加的理想的量不同，哺乳动物基因组总DNA、酵母DNA、细菌DNA、质粒、M13噬菌体作模板时，需要的量分别为1g、10ng、1ng、1pg和1%噬菌斑。

模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。第24页，共100页，2023年，2月20日，星期一5、耐热性的DNA聚合酶有多种，均从耐热性的细菌中分离出来，均耐高温，普遍具有5’→3’聚合酶和5’→3’外切酶活性，但在3’→5’外切酶活性(proofreading,校正功能，决定保真度,fidelity)、耐热性和附加功能上有差异。酶量增加使产量增加，但反应特异性下降，酶量过少虽能保证特异性，但影响产量。常用的有：

1）TaqDNA聚合酶：最常用，来自嗜热水生菌(Thermusaquaticus)，95℃时的半衰期为40分钟，75℃时活性最强，没有校正功能，错配率为8.9×10-5至1.1×10-4。标准使用浓度一般为2.5U/50l。2）TthDNA聚合酶：来自嗜热热细菌(Thermusthermophilus)HB8，95℃时的半衰期为20分钟，74℃时进行扩增，除在Mg2+催化下进行常规的PCR扩增外，还具有在MnCl2催化下的高温反转录功能。

3）VentDNA聚合酶：来自嗜热高温球菌(Thermococcuslitoralis)，100℃时的半衰期为1.8小时，具校正功能，保真度比Taq高5-15倍。第25页，共100页，2023年，2月20日，星期一4）PwoDNA聚合酶：来自嗜热细菌(Pyrococcuswoesei)，100℃时的半衰期大于2小时，有校正功能，保真度高。5）PfuDNA聚合酶：来自激烈热球菌(Pyrococcusfariosus)，具有极高的热稳定性，目前公认是最保真的。

6）混合DNA聚合酶：将具有校正功能的酶与Taq酶按一定比例混合，具有类似Taq的强启动合成能力，同时又有一定的保真度，而且具有一定的扩增长片段的能力。Taq酶的延伸速度为1-2kb/min，但具有校正功能的酶的延伸速度要小些，一般只能按照600-700bp/min来预计。

PCR扩增不是绝对真实的，因为具校正功能的DNA聚合酶只是比不具校正功能的DNA聚合酶相对保真而已，错配率相差在两个数量级以内。一些具校正功能的酶作PCR时，即使产物短也可能得不到产物，原因不明，估计可能与该酶的外切活性将引物降解有关。第26页，共100页，2023年，2月20日，星期一三、PCR反应程序1、常规程序：94℃左右预变性几十秒至几分钟；

94℃左右变性10秒至1分钟；50-65℃左右退火30秒至1分钟；20-35个循环72℃左右延伸30秒至几分钟；72℃左右最后延伸和加尾3-10分钟；4-25℃保持3分钟或更长。2、退火和延伸温度：

退火温度Ta值由Tm值决定，多数情况下Ta采用Tm减去3-5℃，较高时特异性强但退火效率低，较低时退火效率增加而非特异扩增增加，可根据实际研究目的采用高特异性或低特异性退火。当退火温度高到与延伸温度接近时，可以将退火和延伸温度合为一个，这时PCR就由三步法变成了两步法。第27页，共100页，2023年，2月20日，星期一3、反应时间：变性步骤一般为5秒至1分钟，变性温度高时时间短，低时时间长，简单模板时间短，复杂模板时间长，尤其是直接用细胞作模板时预变性和变性时间都要长。

退火时间一般为30秒至1分钟即可，引物结构好的时间短，引物结构差的退火时间宜长。

延伸时间从半分钟到10分钟以上不等，由扩增片段的长度和DNA聚合酶的延伸速度共同决定。Taq扩增时按1kb/min计算，具校正活性的酶则按0.6-0.7kb/min计算。4、循环次数：多数为25-35，主要取决于模板属性、模板丰度、引物退火效率、DNA聚合酶的扩增能力。裸露DNA、杂质少、高丰度模板、引物结构好、DNA聚合酶扩增能力强时，循环数宜少，以尽量减少突变。否则宜多，以保证获得必要的PCR产物量。

PCR扩增的后期循环易进入平台期，实际上是由于PCR扩增条件的逐步劣化而引起的。第28页，共100页，2023年，2月20日，星期一平台效应（plateaueffect）：PCR扩增过程后期会出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。原因：底物和引物的浓度降低dNTP和DNA聚合酶的稳定性或活性降低产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用非特异性产物或引物的二聚体产生非特异性竞争作用扩增产物自身复性高浓度扩增产物变性不彻底Nf=N0(1+Y)nN0起始拷贝数；Nf最终拷贝数；Y延伸效率；n循环数IfNf=1012，Y=70%，N0=3x105，thenn=28.6第29页，共100页，2023年，2月20日，星期一5、PCR反应液的配制：

加试剂顺序：双蒸水、缓冲液、MgCl2、dNTPs、正向引物、反向引物、模板、DNA聚合酶。加DNA聚合酶前应将其余试剂混匀后再加入酶。加完酶后应先放回酶，然后再混匀PCR成分，覆盖矿物油，并上机。

酶要用冰盒取放，禁止因手的接触或暴露于空气中而使酶升温。第一次使用各试剂时要轻柔充分混匀。正确保存各种试剂，尤其是要避免核酸因反复冻融而降解，各试剂宜分装成适量的小管。

热启动(hotstart)：购买的DNA聚合酶偶连有特异抗体，只有当温度升至68度或更高时，抗体才会失活并释放出DNA聚合酶，从而增加PCR的特异性，减少低温下尤其是配制PCR体系过程中由于引物错配而带来的非特异性扩增。但启动的DNA聚合酶的价格较贵。早期有蜡珠法。冷启动(coolstart)：在冰水浴上配制PCR成分，然后立即放到已运行并暂停于预变性之初的PCR仪的block上面，直接进入高温变性和随后的PCR扩增。延迟成分法：扣留一种PCR关键成分，直到已进入预变性后才加入。第30页，共100页，2023年，2月20日，星期一PCR仪第31页，共100页，2023年，2月20日，星期一第32页，共100页，2023年，2月20日，星期一第33页，共100页，2023年，2月20日，星期一1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍第34页，共100页，2023年，2月20日，星期一模板DNA95℃第35页，共100页，2023年，2月20日，星期一PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物第36页，共100页，2023年，2月20日，星期一PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶第37页，共100页，2023年，2月20日，星期一PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第1轮结束第2轮开始第38页，共100页，2023年，2月20日，星期一PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq第39页，共100页，2023年，2月20日，星期一PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束第40页，共100页，2023年，2月20日，星期一PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点重复30轮后230=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2nn循环次数实际拷贝数=(1+x)nX平均效率,约为0.85n循环次数

第41页，共100页，2023年，2月20日，星期一PCR的特点灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个PFU细菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速一次性加好反应液，2～4小时完成扩增扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA第42页，共100页，2023年，2月20日，星期一PCR中其它注意的事项1.防止污染试剂小量分装吸头及EP管一次性使用器皿及工作区域要分开，无菌操作2.设立对照：阳性对照：阳性模板阴性对照：阴性模板、无模板试剂对照：除模板外的所有组分第43页，共100页，2023年，2月20日，星期一第二节PCR产物的克隆一、在PCR产物两端添加限制性酶切位点在PCR引物的5’加上根据需要而设计的酶切位点，PCR产物内部没有该切点。在酶切位点的5’加3个左右的保护碱基，碱基数目多少取决该酶的性质。PCR物产物经电泳后回收后，直接用限制酶进行切割，纯化后与目标载体连接重组。该法适用于直接将PCR产物克隆到表达载体进行功能研究，但构建好的表达载体必须测序才能证明PCR产物的身份正确且没有突变。第44页，共100页，2023年，2月20日，星期一二、TA克隆这是目前最通行的PCR产物克隆方法，基本思路是先将PCR产物与特制的T载体进行连接重组，测序证明正确无误后，再从T载体上亚克隆到表达载体上进行功能研究。Taq酶PCR产物的特点：该酶具有末端转移酶活性，通常在其产物DNA分子每条链的3’末端加上一个突出的A。T载体：通过特定技术制作的在多克隆位点中间已开环的质粒载体，其每条链的3’末端具有一个突出的T，如promega公司的pGEMT-easy。TA克隆：将3’末端具一个突出的A的PCR产物与T载体连接重组，转化大肠杆菌，对鉴定为阳性的重组克隆子的多克隆位点区的插入片段进行测序，然后再亚克隆到其它载体进行功能研究等。pCR-TOPO技术：T载体上已经偶连有拓扑异构酶，因此PCR产物无需DNA连接酶而可直接与该T载体进行快速连接重组。第45页，共100页，2023年，2月20日，星期一第46页，共100页，2023年，2月20日，星期一第47页，共100页，2023年，2月20日，星期一第48页，共100页，2023年，2月20日，星期一第49页，共100页，2023年，2月20日，星期一第50页，共100页，2023年，2月20日，星期一三、平末端DNA片段的克隆所有具有校正功能的DNA聚合酶扩增出来的PCR产物均为平末端，有两种克隆思路：一是在PCR完成后加入适量的Taq酶并在72℃保温20-30分钟，使PCR产物每条链的3’末端加上一个突出的A后进行TA克隆。二是将平末端PCR产物与平末端进行载体连接克隆：1、pCR-ScriptAmpSK(+)克隆载体：连接体系中除加有T4DNA连接酶外，还加有限制酶SrfⅠ，连接过程中载体自连的产物总是被SrfⅠ切开，而重组载体却不能被切开，转化子中重组子的比例就较高。2、pCR-Blunt克隆载体：载体的lacZ’基因下游融合了一个致死基因ccdB，载体自连转化的大肠杆菌不能存活，重组载体的转化子则能长成菌落，因为致死基因已被插入失活。第51页，共100页，2023年，2月20日，星期一第52页，共100页，2023年，2月20日，星期一第53页，共100页，2023年，2月20日，星期一四、长片段DNA的PCR扩增长片段DNA的PCR扩增效率较低，因为有许多降低PCR效率的因素。策略有：一是改进PCR缓冲液体系。二是采用混合酶，尤其是Taq与Pwo的混合酶可扩增40kb左右的片段。第54页，共100页，2023年，2月20日，星期一第55页，共100页，2023年，2月20日，星期一第56页，共100页，2023年，2月20日，星期一第57页，共100页，2023年，2月20日，星期一一、反向PCR(reversePCR)

基本原理:用反向的互补引物来扩增两引物之外的DNA片段。首先用限制性内切酶切割靶DNA片段,并用连接酶,使酶切所得DNA片段自身环化,然后再用内切酶消化核心区,并以该内切酶切点两侧的DNA片段为引物进行PCR扩增,可将邻近已知序列旁侧的未知DNA片段扩增出来。可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。已知序列未知序列未知序列第三节PCR扩增未知DNA片段第58页，共100页，2023年，2月20日，星期一第59页，共100页，2023年，2月20日，星期一第60页，共100页，2023年，2月20日，星期一二、利用接头的PCR/锚定PCR(anchoredPCR)

将基因组总DNA用限制酶切割，然后将序列已知的接头连接到酶切片段的两端，以提供PCR的锚定引物，该锚定引物与已知序列中的基因特异引物(gene-specificprimer,GSP)组合后，用于目标基因侧翼序列的扩增。为了减少锚定引物与锚定引物之间组合后构成的非特异扩增，可以将接头替换为一端平、另一端为5’突起的结构，且对3’凹陷的碱基实行亚氨基修饰。第61页，共100页，2023年，2月20日，星期一同端化PCR基本原理:首先将两条变性的单链DNA的3′端加上同样的特殊引物接头,使其具有相同的末端序列,然后以DNA单链为模板,接头的主体部分为引物,进行PCR扩增得到目的DNA片段。具体方法:将一条具有回文结构的特殊引物接头,加在待扩增的单链DNA片段3′端,然后以其为模板,以该引物接头的5′端主体部分为引物,合成它们的互补链,再通过变性、复性,使新合成的两条链复性。并在DNA聚合酶作用下补平,产生两端都含有所连接引物5′端同一主体序列的模板分子,然后再用该主体序列作引物进行PCR反应,即可使未知序列的基因片段得以扩增。第62页，共100页，2023年，2月20日，星期一第63页，共100页，2023年，2月20日，星期一不对称PCR

目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。用途：制备核酸序列测定的模板制备杂交探针基因组DNA结构功能的研究三、热不对称交错PCR(thermalasymmetricinterlacedPCR,TAIL-PCR)

第64页，共100页，2023年，2月20日，星期一

高浓度引物低浓度引物第65页，共100页，2023年，2月20日，星期一TAIL-PCR：利用特异引物与随机引物组合后进行PCR，产生3种产物：Ⅰ型产物：特异引物和随机引物共同延伸的产物；Ⅱ型产物：特异引物单独延伸的产物；Ⅲ型产物：随机引物单独延伸的产物。5轮高严谨度PCR，形成特异引物介导的目标序列的单链扩增；1个低严谨度PCR循环，将目标序列转换为双链；高严谨度与低严谨度循环交错进行，共14个超级循环；PCR产物稀释1000倍；换用新的特异引物与随机引物进行第二次扩增，10个超级循环；PCR产物稀释1000倍；换用第三特异引物与随机引物进行第三次扩增，10个超级循环；电泳、回收、克隆、测序。第66页，共100页，2023年，2月20日，星期一第一轮扩增

第67页，共100页，2023年，2月20日，星期一第二轮扩增第68页，共100页，2023年，2月20日，星期一第三轮扩增第69页，共100页，2023年，2月20日，星期一基因mRNA蛋白质多肽链第四节与反转录相关的PCR第70页，共100页，2023年，2月20日，星期一逆转录酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA杂合双链PCR扩增第71页，共100页，2023年，2月20日，星期一一、cDNA末端快速扩增(rapidamplificationofcDNAends,RACE)用于克隆全长cDNA的5’和3’末端序列。RACE是利用PCR技术由已知的部分cDNA序列来获得完整cDNA末端的方法,又称为锚定PCR(AnchoredPCR)和单边PCR(One-sidedPCR)。一般有两种RACE策略,分别用于扩增3′或5′端。无论哪一种策略的第一步都需要首先通过反转录把mRNA转化为单链cDNA。在扩增反应中,先根据基因已知部分的序列设计引物;引物(又称锚定引物)带有与cDNA5′或3′端相邻区域互补的序列。这些序列可以是自然存在的,也可以在反转录完成后添加。锚定引物也可以带有接头序列,以方便克隆。第72页，共100页，2023年，2月20日，星期一在5′RACE中,第一条cDNA单链是以与基因中已知序列互补的寡聚核苷酸片段为引物合成的。去掉RNA模板后,用脱氧核糖核苷末端转移酶或T4RNA连接酶在单链cDNA3′端添加一个锚定引物序列尾巴。然后就可以用与基因中已知序列和锚定序列尾巴互补的序列为引物,进行典型的PCR反应。1、

5′RACE

第73页，共100页，2023年，2月20日，星期一第74页，共100页，2023年，2月20日，星期一2、3’RACE在3′RACE中,首先用寡聚(dT)引物/接头做引物进行反转录。这一寡聚(dT)引物可与mRNA的多聚(A)尾巴复性。这一寡聚(dT)引物/接头同时还用来在随后的PCR反应中作为锚定引物。反应中的另一引物与基因中某一特定序列互补。第75页，共100页，2023年，2月20日，星期一第76页，共100页，2023年，2月20日，星期一二、差异显示PCR(differentialdisplayPCR,DD-PCR)检测相似材料表达谱差异的经典方法，此后已衍生出许多新方法。

基本原理：利用一系列寡核苷酸为引物,其中一种锚定于mRNA3′端poly(A)进行反转录,形成mRNA:cDNA杂交分子。然后进行PCR扩增。扩增时在PCR反应溶液中除加入前一种引物外,再加入另一短的随机引物,通过两组引物的随机组合,使细胞中大约15000种mRNA均有扩增的机会,并在序列胶上显示出清晰的电泳带,从中分离出目的DNA片段。利用真核细胞mRNA均含有ploy(A)末端的特点,把其中3′端引物设计成T11VN(V表示为除T以外的三种碱基,N表示四种碱基中的任意一种),所以共有12种组合,分别对总RNA进行反转录,理论上这12种组合刚好覆盖所有mRNA,而且每一种组合均可有效地进行反转录,反应结束时,应全部形成mRNA:cDNA杂交分子。第77页，共100页，2023年，2月20日，星期一mRNA反转录出cDNA后,向反应体系中加入另一个十聚核苷酸的随机引物,连同T引物，进行标记的PCR扩增，然后，通过序列胶分析即可将差异表达条带，即目的条带从中检出，然后再回收DNA，并进行常规PCR扩增，即可得到进行进一步鉴定所需要的量。第78页，共100页，2023年，2月20日，星期一第79页，共100页，2023年，2月20日，星期一DDRT-PCR技术的不足:（1）假阳性率高，假阳性的比例有时高达50％～75％。（2）由于某些序列的特异性，一些差异表达的转录不能得到分离，所以凝胶中的单条带可能由1种以上cDNA片段所构成。（3）差异显示所得的cDNA片段较短，长度多在100bp～400bp之间，且大多位于mRNA3′端约300bp的非翻译区（untranslatedregions,3′UTR），很少能扩增到ORF范围内。（4）研究表明，差显技术对高丰度mRNA具有明显的倾向性，不管用多少个10mer引物，标准的差显技术并不能有效显示细胞中的大量mRNA。

第80页，共100页，2023年，2月20日，星期一一、多重PCR(multiplexPCR)：在一个反应体系中使用一对以上引物的PCR称为多重PCR。其结果是产生多个PCR产物，用于检测特定基因序列的存在或缺失，也可用于多种病原微生物的同时检测或鉴定和病原微生物，某些遗传病及癌基因的分型鉴定。

电泳引物第五节PCR产生的DNA指纹第81页，共100页，2023年，2月20日，星期一二、随机扩增多态性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)：在高等真核生物庞大基因组背景下，引物长度缩短到一定程度以后，单一引物就可以扩增出多个PCR产物。RAPD引物一般为10-11nt。它的应用是基于这样的一个推理：对于不同模板DNA，用同一引物扩增既可能得到相同的带谱（模板基因组间可能具有同源性），也可能得到不同的带谱。仅在某一特定模板中出现的条带就可作为该模板的分子标记。事实上，不同基因组DNA总是一定差异的，所以用RAPD就可以进行分子标记研究。理论上讲，在一定的扩增条件下，扩增的条带数取决于基因组的复杂性。对特定的引物，复杂性越高的基因组所产生的扩增条带数也越多。第82页，共100页，2023年，2月20日，星期一第83页，共100页，2023年，2月20日，星期一第84页，共100页，2023年，2月20日，星期一RAPD技术目前运用相当广泛，几乎渗透于整个基因组研究的各个方面，这与它所具有的众多优势是分不开的。①无需专门设计RAPD扩增反应引物，也无须预先知道被研究生物基因组的核苷酸序列，引物可随机合成和随机选定，长度一般为9-10个核苷酸；②每个RAPD反应中，仅加单个引物，就可通过引物和模板DNA随机配对实现扩增，扩增无特异性；③退火温度低，一般为36℃，这样的温度能保证核苷酸引物与模板的稳定结合，同时允许适当的错误配对，以扩大引物在基因组DNA中配对的随机性，使RAPD有较高的检出率；④RAPD技术简便易行、省时省力。RAPD易于程序化，利用一套随机引物可得到大量的分子标记，并可借助于计算机系统进行分析；⑤RAPD分析所需的DNA样品量极少，这对于生物早期取样鉴定或在DNA受限制的情况下是十分有利的。第85页，共100页，2023年，2月20日，星期一RAPD的缺点：

(1)RADP图谱中某些弱带重复性较差，而且目前该法在引物长度和序列及应用的引物数目、扩增反应条件等实验技术方面未标准化，影响了不同条件下结果的可比性；(2)每个标记含有的信息量小；(3)有假阳性或假阴性结果；(4)显性标记，无法区分从一个位点扩增的DNA片段是纯合的还是杂合的，无法进行等位基因分析；(5)用在种以上类群间的比较时无法得到可靠的遗传距离。第86页，共100页，2023年，2月20日，星期一三、扩增片段长度多态性(amplifiedfragmentpolymorphism,AFLP)：将高等真核生物基因组DNA酶切，连接接头，然后进行选择性PCR扩增。基本原理：基因组DNA经限制性内切酶酶切后，产生分子量大小不同的限制性片段。使用特定的双链接头与酶切DNA片段连接作为扩增反应的模板，用含有选择性碱基的引物对模板DNA进行扩增，选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性，只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可被扩增。扩增产物经放射性同位素标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后根据凝胶上DNA指纹的有无来检验多态性。引物由三部分组成：①核心碱基序列，该序列与人工接头互补；②限制性内切酶识别序列；③引物3’端的选择碱基。选择碱基延伸到酶切片段区，这样只有那些两端序列能与选择碱基配对的限制性酶切片段被扩增。AFLP技术包括三个主要内容：①模板的制备；②片段的扩增；③聚丙烯酰胺变性胶电泳分离检测。第87页，共100页，2023年，2月20日，星期一被扩增的DNA限制性酶切片段由二个限制性内切酶产生，一个为酶切位点较少的限制性酶（如EcoRI），另一个为多酶切位点的限制酶（如MseI）。采用双酶切的原因：

①多位点酶切产生小的DNA片段，这些片段易被扩增且片段长短适宜在变性胶上分离；②切点数少的酶可减少扩增片段的数目。由于扩增片段是由多切点酶和切点数较少的酶酶切后产生酶切片段，这样就可选择扩增时所需的选择碱基数目限制在一定的范围内；③利用双酶切使对PCR产物的单链进行标记成为可能，从而防止胶上由于扩增片段双链迁移率不一致而造成的双带现象（doublets）；④双酶切可以对扩增片段的数目进行灵活调节；⑤通过少数引物可产生许多不同的引物组合，从而产生大量的不同的AFLP指纹。第88页，共100页，2023年，2月20日，星期一第89页，共100页，2023年，2月20日，星期一第90页，共100页，2023年，2月20日，星期一AFLP技术主要特点：（1）分析所需DNA量少，仅需0.5μg。（2）可重复性好。误差小于0.6%。（3）多态性强。AFLP分析可以通过改变限制性内切酶和选择性碱基的种类与数目,来调节扩增的条带数,具有较强的多态分辨能力。（4）分辨率高。（5）样品适用性广。AFLP技术适用于任何来源和各种复杂度的DNA。（6）稳定的遗传性。AFLP标记在后代中的遗传和分离中符合Mendel