研制具有较高免疫保护作用的DNA疫苗课件

研制具有较高免疫保护作用的SjserpinDNA疫苗

立项依据目前我国仍有108个县有血吸虫病流行，69.5万人感染血吸虫病，并且随着近年来长江洪水泛滥和退耕还湖又有重新升高的趋势[1]。多年来，控制血吸虫病以化疗为主．辅以易感地带灭螺的综合性防治措施，取得较好的效果。但由于在流行区化疗停止后再感染迅速出现和长期、反复、大规模使用吡喹酮化疗，血吸虫对吡喹酮的潜在耐药性，迫切需要发展血吸虫疫苗以补充血吸虫病的防治措施[2]。DNA疫苗作为一种新型的疫苗，已在包括寄生虫感染在内的多个领域内开展了广泛研究[3]．但是现行的酶抗原，血吸虫肌球蛋白组抗原，血吸虫膜相关蛋白，血吸虫钙相关蛋白，血吸虫线粒体相关蛋白和信号蛋白，血吸虫性别相关蛋白等制作出的DNA疫苗的免疫保护效果仅有小幅增加[4]。最新研究表明，来自哺乳动物内部的消化酶：胰蛋白酶和胰弹性蛋白酶(PE)很容易被抑制[5],以纤溶酶原激活物抑制因子2为代表了一种细胞抑制剂（serpin）可以通过一种独立的途径（不经过内质网和高尔基体）分泌到细胞外[6]。据文献[7]报道多房棘球绦虫六钩蚴入侵人体阶段，分泌的serpin，能够阻断宿主消化酶的酶解攻击，这样，Sjserpin就可以在免疫系统做为一个靶位，引发免疫反应[8]。因此，本实验将能够表达serpin的血吸虫的一段cDNA进行PCR扩增，制作出SjserpinDNA疫苗，并对小鼠保护性免疫进行检测，进而为人类血吸虫防治提供新思路。

实验摘要提取全长的日本血吸虫中国大陆株丝氨酸蛋白酶抑制剂(Sjserpin)基因，并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1，构建DNA疫苗

pcDNA3.1—serpin；制备SjserpinDNA疫苗和对照pcDNA3.1。将20只BALB/c小鼠随机分为A、B2组。A组小鼠肌注100ugpcDNA3.1；B组注射100ugpcDNA3.l-Sjserpin。每隔2周各免疫1次，共3次。第8周每鼠感染30±2条／只尾蚴，45d后剖杀，计数成虫及肝内虫卵。采用免疫组化法检测局部组织中Sjserpin的表达；用脾细胞培养法检测经Sjserpin刺激后．攻击前、后小鼠脾细胞IL-2,IL-4,IL-10和IFN-r的水平。用ELISA检测血清中抗Sjserpin抗体。

实验方法步骤

1.1

1.1引物的设计与合成根据Sjserpin的基因序列设计两条引物P1和P2，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，分别在Pl和P2的5'端引入BamHI和Xhol的酶切位点。以日本血吸虫童虫cDNA文库为模版进行PCR扩增。1.DNA疫苗pcDNA3.1-Sjserpin的制备Sjserpin亚克隆入pcDNA3.1

1.2

将PCR产物与T载体pMD18-T连接，并转化感受态细菌，培养提取Sjserpin，并以此为模板进行PCR扩增，产物Sjserpin再与pcDNA3.1连接，用同样方法得到重组质粒[9]。重组质粒经酶切鉴定，作DNA测序进一步确认。

1.3

DNA疫苗pcDNA3.1，pcDNA3.1-Sjserpin的制备按说明书用大规模质粒纯化试剂盒Qiagen2500大量制备，制得的质粒。DNA溶解于无菌的生理盐水(0.9％)中．在核酸蛋白测定仪上测定OD值，计算DNA浓度。

2.动物保护性实验将20只小鼠随机分为A，B2组，每组10只。A组(pcDNA3.1组)经小鼠股四头肌注射100ugpcDNA3.1质粒DNA；B组(Sjserpin组)注射100ugpcDNA3.l-sjserpin质粒DNA。分别于第0、2、4周各免疫接种一次（剂量和方法相同)．于第8周每鼠以30+/-2条／只尾蚴用腹部贴片法攻击感染，攻击后45d剖杀小鼠收集成虫计数，取出肝脏称重后用5％KOH37℃消化过夜，进行虫卵计数。按公式：减虫率=(对照组平均每鼠成虫数-实验组平均每鼠成虫数)／对照组平均每鼠成虫数×100％．减卵率=(对照组平均每鼠虫卵数一实验组平均每鼠虫卵数)/对照组平均每鼠虫卵数×100％．计算减虫率及减卵率。

3.2

细胞因子检测访谈结果与析双抗体夹心法分别于攻击前后2周每组各取两只小鼠拉颈处死，取出脾脏，常规法制备单个脾细胞悬液，用10％FCSRPMI1640完全培养液调整细胞浓度为6*10^3个／ml，每孔加入100ul脾细胞。每组分别用100ConA(10ug／ml)和serpin(10ug／m1)进行刺激。空白孔加入100ul10％FCSRPMI1640，于5％CO237℃培养72h，离心收集上清进行细胞因子检测。细胞因子检测按说明书采用双抗体夹心法。

3.3

抗体检测攻击前2周各组分别取6份血清、攻击后各组取6份血清．用ELISA法检测血清中的Sjserpin抗体。

参考文献[1]．陈贤义．姜庆五，赵根明．等2000年全国血吸虫疫情通报，中国血吸虫病防治杂志，2000．13：129-131.[2].McManusDP.AvaccincagainstAsiaschistosonnasis:ticcstoryandunfolds,IntJParasitol.2000，30：265—27l.[3]．RamsayAJ.RamshawLA,AdaGL.etal.DNA1997．75：360365.[4].曹建平，李小红，刘述先我国血吸虫疫苗研究进展和展望，中国传染病杂志，2005.12第23卷第六期.[5].ArminMerckelbach,AndreasRuppelBiochemicalpropertiesofanintracellularserpinfromEchinococcusmultilocularis.156(2007)84–88.[6].RitchieH,BoothNA.Secretionofplasminogenactivatorinhibitor2byhumanperipheralbloodmonocytesoccursviaanendoplasmicreticulumgolgi-independentpathway.ExpCellRes1998;242:439–50.[7].PrevotPP,AdamB,ZouaouiBoudjeltiaK,etal.Anti-haemostaticeffectsofaserpinfromthesalivaofthetickIxodesricinus.JBiolChem2006;281:26361–9.[8].ArminMerckelbach,AndreasRuppelBiochemicalpropertiesofanintracellularserpinfromEchinococcusmultilocularis.156(2007)84–88.[9].王阳阳，刘淼，朱绍春等日本血吸虫表膜蛋白Tetraspanin2-A基因的克隆、表达与鉴定中国寄生虫学与寄生虫病杂志2008.2第26卷第一期[10].汪世平，高冬梅，何卓，余路新等日本血吸虫核糖体蛋白SjRPS4、SjRPL7DNA疫苗对小鼠免疫保护作用研究1002—2694(2010)02—0097—04.

本项目创新之处

首先，DNA疫苗疫苗做为第三代疫苗广泛被人研究，它与传统的疫苗相比有许多优点：①安全可靠，其生产过程中不需要大量病原体的培养，无减毒活疫苗可能引起的致病作用；②更为有效，可引起细胞免疫及体液免疫反应；③制备简便，只需要对编码抗原的基因进行设计和克隆，不需要在体外表达和纯化蛋白；④价格低廉、使用剂量低、便于运输保存、易于构建和大规模生产；⑤DNA疫苗可能作为细胞内的“抗源储藏器”，抵抗抗体的廓清，在没有免疫接种的情况下，连续不断地产生蛋白产物刺激免疫系统，从而保持长期的免疫记忆，甚至可终生免疫；⑥不同DNA序列组成的混合DNA疫苗可对付变异抗原的侵袭；⑦可针对相同或不同病原体的几种抗原进行联合免疫。其次，以血吸虫表达的serpin