第二章基因工程的工具酶

第二章基因工程的工具酶第1页，共28页，2023年，2月20日，星期一1.工具酶的概念应用与基因工程的各种酶的总称.大量应用的是核酸酶.切:限制性内切酶连:

DNA连接酶修饰酶，聚合酶第2页，共28页，2023年，2月20日，星期一/listplay/sJj53SXK_PQ/-TXTvgODA4I.html/listplay/sJj53SXK_PQ/u-6RLhVXzv0.html?FR=LIAN第3页，共28页，2023年，2月20日，星期一几乎所有细菌均可产生限制性内切酶。1962年，瑞士的W.Arber提出限制与修饰假说。限制性内切酶：识别特定序列DNA甲基化酶：甲基化该特定序列，保护细菌DNA第4页，共28页，2023年，2月20日，星期一2.限制性内切酶I型：随机切割，核酸内切酶，甲基化酶，ATP酶，DNA解旋酶II型：仅识别特定DNA序列，广泛应用III型：具有限制和修饰双重作用，应用较少第5页，共28页，2023年，2月20日，星期一限制性内切酶的命名基本名称具该酶的机体属名的第一个字母（大写）种名的前两个字母（小写）大肠杆菌Escherichiacoli流感嗜血菌Haemophilus

influenzae短杆菌Brevibacteriumalbidum粘质沙雷式菌Serratiamarcescens第6页，共28页，2023年，2月20日，星期一同一菌种具有不同的菌株或菌型基本名称

菌株或菌型(小写)大肠杆菌k型菌株Ecok流感嗜血菌d型菌株Hind限制酶由染色体外的成分，如病毒、质粒等引起基本名称质粒、病毒的辅助字母EcoR第7页，共28页，2023年，2月20日，星期一某一菌株具有多个不同的限制酶体系，用罗马字母表示发现的先后顺序Hind

II:EcoR

I:第8页，共28页，2023年，2月20日，星期一有的限制酶前冠以系统名R

：限制性核酸内切酶，常省略M：甲基化酶R.Hind

IIIM.Hind

III第9页，共28页，2023年，2月20日，星期一限制酶的识别位点II型限制酶的识别系统识别4~6个碱基对，一般富含GC；少数识别6个以上的碱基对，为稀有酶识别序列具有回文结构识别序列严格，少数仅识别一二位专一第10页，共28页，2023年，2月20日，星期一限制酶剪切方式产生5’突出的黏性末端产生5’突出的黏性末端产生平齐末端第11页，共28页，2023年，2月20日，星期一II型限制酶的反应条件U-一个单位的限制性内切酶合适的温度和缓冲液，20ul体系，1h降解1ugDNA所需酶量注意酶的稀释与保存第12页，共28页，2023年，2月20日，星期一影响限制酶活性的因素DNA纯度DNA甲基化程度酶切反应的温度DNA的分子结构缓冲液第13页，共28页，2023年，2月20日，星期一3.DNA连接酶连接酶的作用是：将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的DNA分子。在DNA复制、修复及体内外重组过程中起着重要作用。第14页，共28页，2023年，2月20日，星期一连接机理一条DNA链上的3’游离羟基与另一条DNA链上的5’末端磷酸基团形成3’,5’-磷酸二脂键。第15页，共28页，2023年，2月20日，星期一DNA连接酶的种类(1).T4噬菌体DNA连接酶不受dNTP的抑制，催化DNA片断的连接。(2).E.coliDNA连接酶不能连接平端DNA,不能连接RNA。第16页，共28页，2023年，2月20日，星期一T4噬菌体DNA连接酶广泛应用，可以连接：两个带有互补黏性末端的双链DNA分子两个带有平头末端的双链DNA分子一条链带有切口的双链DNA分子RNA-DNA杂合体中RNA链切口，RNA末端与DNA连接第17页，共28页，2023年，2月20日，星期一DNA连接酶反应体系12~30℃下反应1~16h。黏性末端：12~16℃，保证退火、酶活性、反应速率间的平衡平头末端：10~20℃，10~100倍酶量终止反应：EDTA或75℃水浴第18页，共28页，2023年，2月20日，星期一影响连接反应的因素DNA末端的结构DNA片段浓度相对分子量反应温度离子浓度第19页，共28页，2023年，2月20日，星期一4.DNA聚合酶催化合成DNA的反应的酶第20页，共28页，2023年，2月20日，星期一DNA聚合酶分类依赖DNA的聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶I大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow大片段酶T4

DNA聚合酶T7

DNA聚合酶Taq

DNA聚合酶依赖于RNA的DNA聚合酶逆转录酶第21页，共28页，2023年，2月20日，星期一依赖DNA的DNA聚合酶(1)大肠杆菌DNA聚合酶I（E.coliDNApolI)：具有三种酶活性a、5’---3’DNA聚合酶活性CCGATA-OHE.coliDNApolICCGATAGCCTGGCTATCGGAMg2+dNTP

GGCTATCGGAb、3’---5’外切酶活性-校正作用CGCATCG-OHE.coliDNApolICGCATCGGCGMg2+dNTPGCGc、5’---3’外切酶活性CGCATTAGE.coliDNApolICATTAGGCGTAATCMg2+GCGTAATC第22页，共28页，2023年，2月20日，星期一大肠杆菌DNA聚合酶I制备杂交探针。Mg2+，低浓度DNA聚合酶I，同位素标记的核苷酸处理双链DNA产生单链DNADNA聚合酶I5’—3’外切酶活性和聚合酶活性同时发生，产生切口平移，形成带标记的DNA分子第23页，共28页，2023年，2月20日，星期一(2).Klenow酶：也称DNA聚合酶I大片段，只是从DNA聚合酶I全酶中去除了5’--3’外切酶活性Klenow酶的基本用途：a.补平由核酸内切酶产生的5‘粘性末端b.DNA片段的同位素末端标记c.cDNA第二链的合成d.双脱氧末端终止法测定DNA序列第24页，共28页，2023年，2月20日，星期一(3)TaqDNA聚合酶：耐热的DNA聚合酶PCR反应扩增所需酶具5’-3’聚合酶活性和3’-5’外切酶活性（4）逆转录酶体外mRNA为模板合成互补的DNA第25页，共28页，2023年，2月20日，星期一5.碱性磷酸酶去除DNA或者RNA的5‘’磷酸，可防止自身环化。

5’pDNA5’OHDNA5’pRNA5’OHRNA第26页，共28页，2023年，2月20日，星期一6.末端转移酶分子量60000D,在二价阳离子的作用下，催化dNTP加于DNA分子的3’羟基端。底物：带3’羟基端单链DNA或带3’羟基突出端的双链DNA。第27页，共28页，2023年，2月20日，星期一7.核酸酶S1S1核酸酶的基本特性：来自稻谷曲霉菌（A