毒理学评价研

毒理学评价研第1页/共71页转基因食品食用安全检测技术第2页/共71页温故而知新

2012.9.28食品毒理学评价分为几个阶段？每一个阶段的主要试验？第3页/共71页第三阶段亚慢性毒性试验，90天喂养，繁殖试验，代谢试验第四阶段慢性毒性试验，2年喂养，致癌试验第二阶段亚急性毒性与致突变试验：短期喂养Ames试验微核试验精子畸形第一阶段急性毒性试验第4页/共71页二、毒理学评价方法在转基因食品安全性评价中应用与案例外源基因表达产物的毒理学检测全食品的毒理学检测第5页/共71页毒理学检测方法检测对象：外源基因表达产物全食品检测依据：OECD关于化学物质评价方法(OECD,1995)《食品安全性毒理学评价程序和方法》第6页/共71页外源基因表达产物的毒理学检测第7页/共71页外源基因表达产物的毒理学检测1氨基酸序列同源性比较2加热和模拟胃肠道消化稳定性3动物急性经口毒性试验第8页/共71页氨基酸序列同源性比较通过对基因序列数据库EMBL和蛋白质序列数据库的SWISSPORT的查询中，共发现毒蛋白1458种。第9页/共71页第10页/共71页第11页/共71页序列比对工具BLAST是在蛋白质序列库中搜索氨基酸序列的工具FASTA是常用的核酸和蛋白质序列库搜索程序一般相似性程度极高的E值一般小于1e-7第12页/共71页加热和模拟胃肠道消化稳定性试验条件：加热：95℃，5-30min模拟胃肠道：离子、pH、酶活、温度检测方法：蛋白电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳免疫学方法：酶联免疫（ELISA）和蛋白免疫杂交（Westernblot）生物活性检测与比较第13页/共71页Caoetal.RegulatoryToxicologyandPharmacology.2010,58(3):474-81.热稳定性模拟消化稳定性第14页/共71页急性毒性试验

由于蛋白质类毒素对哺乳动物的毒性作用通常为急性模式，因此，对于外源蛋白的毒性检测首先关注其急性毒性。第15页/共71页试验目的测定LD50；对受试物进行急性毒性分级，为其他试验剂量设计提供参考试验动物啮齿类：大小鼠非啮齿类：犬、猴第16页/共71页急性毒性试验试验方法按照《食品安全性毒理学评价程序与方法—急性毒性试验》（GB15193.3-2003）标准程序进行。设空白对照组，阴性对照组（牛血清白蛋白），外源蛋白组（来源于转基因植物或重组大肠杆菌）。一次性或24h内多次灌胃动物一定剂量的蛋白，观察7~14天，观察中毒表现，统计死亡数，计算半数致死量LD50。第17页/共71页急性毒性试验结果分析毒性分为极毒，剧毒，中等毒性，低毒，实际无毒，无毒六种情况。如果蛋白的灌胃量≥5g/kg体重，仍未对动物产生毒性作用，则认为这种蛋白是安全的。也有用人类最大可能暴露量的1000倍或5000倍作为安全系数。第18页/共71页急性毒性试验结果判定：LD50剂量小于人的可能摄入量的10倍，则放弃该受试物用于食品LD50大于10倍，可进入下一阶段的毒理学试验。LD5010倍左右，应进行重复试验，或者用另一种方法进行验证第19页/共71页案例：新霉素磷酸转移酶II（NPTII）的急性毒性试验试验方法：选用80只CD-1小鼠，分成四组，每组雌雄各10只，分别灌胃0，100，1000，5000mgNPTII蛋白/kg体重。灌胃后，动物自由进食与饮水，每天观察两次动物的死亡与中毒情况。在第1天与第7天称量动物体重，第7天称量动物进食量。第8天与第9天处死动物，进行大体病理学检查。Fuchs,R.L.etal.Bio/Technology,1993,11,1537-1547第20页/共71页试验结果：全部小鼠均存活，且未发现与处理有关的临床症状。试验期间，全部小鼠的体重均有所增加，并且处理组与对照组的体重增加与进食量无处理相关的显著性差异。大体病理观察也未发现脏器病变。因此蛋白急性口服的最大耐受剂量确定为＞5000mg／kg体重。Fuchs,R.L.etal.Bio/Technology,1993,11,1537-1547第21页/共71页

如何计算急性毒性剂量是人类摄入量的多少倍？

GlobalEnvironmentMonitoringSystem-FoodContaminationMonitoringandAssessmentProgramme(GEMS/Food)——WHO

第22页/共71页第23页/共71页第24页/共71页第25页/共71页第26页/共71页全食品的毒理学检测第27页/共71页全食品的毒理学检测急性毒性试验致畸试验亚慢性毒性试验繁殖试验第28页/共71页急性毒性实验案例1：抗除草剂转基因水稻的安全性评价实验前稻米碾成粉，80℃下2h烘熟。用1%羧甲基纤维素溶解。选40只健康成年ICR小鼠，雌雄各半。随机分成两组，每组20只，雌雄各半。分别灌胃30g/kg·bw剂量转基因水稻和阴性对照(1%羧甲基纤维素)。24h内4次灌胃，观察10d后处死小鼠。观察肝、肾、脾、胸腺等脏器的形态特征。第29页/共71页试验结果：实验期间，两组小鼠均未见明显中毒症状，也无死亡。观察小鼠的肝、肾、脾、胸腺等脏器均无异常变化,病理检查各脏器均无异常改变。抗除草剂基因(bar)转基因稻米对雌雄小鼠经口LD50

均大于20g/kg体重说明属无毒类薛大伟等.农业生物技术学报,2005,13,723-727第30页/共71页急性毒性试验案例2：转基因大豆油急性毒性实验取健康小白鼠40只。雌雄各半，随机分为4组，每组l0只小鼠(雌雄各半)。对照组一次性灌服生理盐水40mL/kg·bw，实验组分高、中、低3组，分别一次性灌服转基因大豆油40、20、10mL/kg·bw，观察10d。第31页/共71页小白鼠服油10d后，无一只动物死亡。一次给药无法测出LD50。加大药量，一次给予最大量，对照组一次性灌胃生理盐水80mL/kg继续观察10d.未发现动物有任何局部或全身的中毒症状，无一只动物死亡。实验组除有个别动物粪便稀软外，和对照组无任何差异。实验结果表明，转基因油对小鼠灌胃的最大耐受量为60mL/kg，相当于日平均用量的126倍。王岚等.中国油脂,2004,11,42-46.第32页/共71页致突变试验Ames试验：选用经鉴定符合要求的鼠伤寒沙门氏组氨酸缺陷型实验菌株采用平板掺入法，将受试物和菌液，加入顶层琼脂中，混匀，迅速倒入底层培养基上37℃培养48h，计数每皿回变菌落数。当受试物回变菌落数超过自发回变的2倍以上并有剂量——反应关系时即可判定为阳性。第33页/共71页致突变试验小鼠骨髓细胞微核试验：选用体重26～30gICR小鼠，每组10只，雌雄各半各组均采用2次经口给受试物，中间间隔24h，于第2次给受试物后6h处死动物取一侧股骨制备骨髓涂片。Gimsa染色后镜检计数嗜多染红细胞中的微核发生率第34页/共71页小鼠精子畸形试验：选体重25～29g雄性性成熟小鼠连续5天经口给予受试物，每天1次。第35天处死动物取两侧副睾，制备精子标本，伊红染色，高倍镜下检查每只动物的精子形态，计数结构完整精子1000个，记录畸形精子数，计算精子畸形率。第35页/共71页致突变试验案例：抗除草剂转基因水稻三致试验薛大伟等采用了微核、精子畸变和组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌株回变菌落数（Ames）等细胞水平的试验对抗除草剂转基因水稻进行了致畸性试验研究。没有发现转基因水稻产生致突变毒性。薛大伟等.农业生物技术学报,2005,13,723-727第36页/共71页试验方法第37页/共71页试验结果第38页/共71页试验方法第39页/共71页试验结果第40页/共71页试验方法第41页/共71页试验结果第42页/共71页亚慢性毒性试验传统的化学物质的安全性评价经验已经证实：与更长时间的喂养实验相比，90天的动物喂养实验已经足够反映出受试物的毒性作用。NY/T1102－2006《转基因植物及其产品食用安全检测大鼠90d喂养试验》第43页/共71页亚慢性毒性试验

（90天喂养试验）试验目的

观察采用转基因食品长期饲喂动物后产生的毒性、营养学及非期望作用。试验动物啮齿类：大小鼠非啮齿类：小型猪、犬第44页/共71页亚慢性毒性试验试验方法选用出生后6-8周的SD或Wistar大鼠。随机分组，试验开始时各动物体重之间的差异应不超过平均体重的±20％。每组至少20只动物，雌、雄各半。设转基因组、非转基因对照组和常规基础饲料空白对照组。转基因组和非转基因对照组至少设低、中和高三个剂量组。第45页/共71页亚慢性毒性试验剂量选择在营养平衡的基础上，应以饲料中最大掺入量作为高剂量组。转基因植物及其产品与传统对照物在饲料中的比例应一致。饲料中其它各主要营养成分的比例和饲料的最终营养素含量也应一致。第46页/共71页检测指标日常观察：一般表现、行为、毒性表现和死亡数量营养利用：称量体重和进食量，计算体重增重和食物利用率

血常规：血红蛋白、红细胞计数、白细胞计数及分类、血小板数

血生化：丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶、尿素氮、肌酐、血糖、血清白蛋白、总蛋白、总胆固醇和甘油三酯

第47页/共71页检测指标大体解剖：解剖和肉眼观察各脏器外部异常表现

脏器重量：心脏、肝、肾、肾上腺、脾、胸腺、睾丸的绝对重量和并计算相对重量（脏/体比值），进行组织、器官的组织病理学检查第48页/共71页亚慢性毒性试验案例：59122转基因玉米大鼠90天喂养试验

59122抗虫玉米是美国杜邦公司研发的含有一种抗除草剂筛选基因（pat）与两种抗虫基因（cry34Ab1与cry35Ab1）的抗虫转基因玉米品种。目前已经得到美国，日本，加拿大，澳大利亚，墨西哥，中国等国家的批准，应用于食品与饲料。Malley,L.A.,etal.2007.FoodChem.Toxicol.45,1277–1292.第49页/共71页亚慢性毒性试验Step1成分检测：营养成分，抗营养因子，次级代谢产物以及抗虫剂残留。Step2身份验证：PCR——分子验证

ELISA——外源蛋白质验证Step3饲料配制：转基因玉米59122

非转基因对照玉米35%

普通玉米第50页/共71页亚慢性毒性试验Setp4饲料分析：营养成分、抗营养成分、杀虫剂残留Step5饲料外源蛋白检测：ELISA检测外源蛋白的含量进行检测Step6动物喂养：选用SD大鼠100只，每组雌雄各10只。第51页/共71页亚慢性毒性试验Step7临床观察：每天至少观察两次死亡情况，以及行为、外表的非正常现象。每周进行一次外表、行动的全面检查。在实验开始与结束时各进行一次全面的眼科检查，感官功能检查与运动机能检查。Step8指标诊断：在第7周与第13周，检测动物的血常规，血生化以及尿常规。第52页/共71页Step9病理检查：大体解剖，称量脏器重量，并对消化系统，尿液系统，呼吸系统，心血管系统，造血系统，内分泌系统，脊髓，肌肉系统以及生殖系统进行病理切片检查。Step10统计分析：对转基因组的结果与其他四组对照的结果进行统计学比较。第53页/共71页体重增长进食量第54页/共71页致畸试验试验目的

检测转基因食品或其外源蛋白体内或体外的致畸作用。试验动物

传代试验：大小鼠第55页/共71页致畸试验试验方法传代试验：将转基因食品与非转基因对照分别以一定比例添加到饲料中，喂养大鼠至成年，对雌雄交配后的受孕率、产生的胎儿进行检测，推断转基因食品是否对大鼠后代产生致畸反应。第56页/共71页致畸试验传代试验检测指标：受孕率：观察雌鼠交配情况,检查到阴栓后，记录受孕时间，将雌性单独喂养。孕鼠增重：每周称孕鼠体重2次，计算孕鼠增重情况。胎鼠生长发育：观察孕鼠胚胎着床情况，记录活胎数、死胎数、吸收胎数。测活胎身长、体重，计算窝平均体重和窝平均胎盘重。第57页/共71页致畸试验传代试验检测指标：畸形观察：将每只孕鼠所产活胎随机分为2部分,一组观察内脏畸形；另一组观察骨骼畸形。畸胎率=出现畸形的胎仔总数/活产胎仔总数×100%畸形率=畸形总数/活产胎仔总数×100%第58页/共71页毒性评价——致畸试验案例：转Xa21基因水稻大鼠传代致畸试验李英华等分别用转基因大米、非转基因大米和基础饲料喂养亲代大鼠，并以敌枯双注射组作为阳性对照组。

90天后雌雄合笼，观察母鼠和胎鼠的生长发育情况。结果显示，转基因大米组与非转基因大米组相比，大鼠受孕率、胚胎生长情况均无显著性差异。第59页/共71页繁殖试验案例：转Bt基因稻谷大鼠三代繁殖试验试验方法选体重70-80克SD大白鼠共200只，雌雄各半，随机分成五个组。饲喂不同剂量转基因稻谷。分笼饲养，分别以不定量方式喂养动物12周后，雌雄大鼠按1：1同笼交配，次日晨检查雌鼠。发现阴道有阴栓或涂片显微镜检查阴道分泌物有精子存在，确定为受孕0天。取出雄鼠，让雌鼠继续摄食不同剂量的Bt稻谷饲料。动物称重、编号、单笼饲养，受孕第21天后，观察并记录动物产仔情况。第60页/共71页第61页/共71页试验结果1）各代中Fa与Fb代比较，其重量基本上