动物克隆 第三章胚胎干细胞分离培养

第三章胚胎干细胞分离培养1981年,Evens等首次发现小鼠胚胎干细胞(embryonicstemcells,ESCs)在体外具有稳定增殖并维持未分化状态及分化全能性潜能的特性,并成功建立小鼠ESCs系［1］。由于ESCs独特的生物学特性,ESCs方面的研究迅速成为生命科学研究领域的热点之一,1999年－2000年连续两年被评为世界十大科技新闻。ESCs已成为分子遗传学、发育生物学、细胞工程、组织工程等研究的重要工具,在研究细胞分化机制、临床治疗、转基因等方面有着重要的意义。随着对干细胞研究的不断深入,人们将逐渐掌握和利用干细胞,还将推动相关学科的发展。文章综述了ESCs的研究概况、体外分离培养、生物学特性、鉴定方法、影响ESCs分离培养的因素、存在问题以及应用前景等。胚胎干细胞研究概况ESCs的研究最早要追溯到畸胎瘤细胞的发现,但真正意义上的开始却是1981年Evens等首先从延缓着床的胚泡分离培养到小鼠的ESCs，并建立小鼠的ESCs系，之后ESCs研究迅速发展，已在大鼠、仓鼠、猪、牛、水貂、兔、山羊、绵羊、恒河猴和人等多种哺乳动物上建立了类ESCs系［2］。近几年来，ESCs研究在ESCs来源与培养方法、探索建立和维持ESCs系的条件、定向诱导分化、遗传操作、疾病动物模型的治疗等方面取得了一定的进展。研究人员利用体细胞核移植技术进行胚胎重建，从克隆胚胎中成功得到小鼠、兔和人等多种哺乳动物ESCs［3-5］；利用孤雌激活技术建立小鼠和非人灵长类孤雌激活胚胎源的ESCs系［6］，这些为ESCs的分离克隆开辟了新的途径。利用定向诱导分化技术成功将ESCs分化为造血细胞、内皮细胞、肝细胞、脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞、胰岛细胞、心肌细胞、成骨细胞，甚至滋养层细胞和生殖细胞等所有3个胚层的细胞类型［7-13］。试验表明，人ESCs能有效治疗心肌梗死、糖尿病、中风等疾病。国内在ESCs方面的研究起步较晚，但发展迅速，在相关领域做了大量的研究。丛笑倩等［14］最早分离并建立了129-C3H小鼠ESCs系。随后，胡立新等［15］得到小鼠ESCs种系嵌合体。何志旭等［16］从人囊胚内细胞团分离培养并建立了3株人类ESCs系，在体外分别传代至40代、32代和30代，使我国跻身于该项研究先进行列，这是我国第1株能稳定传代的中国人类ESCs系。董雅娟等［17］由牛的体细胞克隆胚分离获得了类ESCs集落，为ESCs的获得提供了一种途径。胚胎干细胞的体外培养ESCs的分离培养过程，通常是将桑椹胚细胞、囊胚内细胞团或胎儿原始生殖细胞接种到培养体系中进行抑制分化培养，类ESCs增殖形成岛状或巢状集落后，挑选典型集落用消化液消化离散细胞，接种到新的培养体系中，反复传代，获得纯度高、能稳定传代并维持未分化状态和全能性的ESCs［20］。胚胎干细胞的分离方法以早期胚胎为材料首先要获得内细胞团(innercellmass,ICM)。由囊胚分离培养ESCs时要分离ICM通常有两种方法［18-19］：第一种方法是把获得的囊胚放于培养体系中培养,使其自然发育孵出并贴壁生长,形成清晰的细胞集落后将其挑选出来进行培养；第二种方法是免疫外科手术法,去除透明带后,通过抗原抗体反应使滋养层细胞肿胀松散,然后吹打将其去除［18-19］。将得到的ICM细胞培养在长有饲养层细胞的培养皿中。以原始生殖细胞(primordialgermcells,PGCs)为材料,可根据不同物种,采集胎儿的特定组织,可直接培养,也可经消化离心等过程制备含PGCs的悬浮液，再接种于新制备的饲养层上。待其充分增殖后,挑取、消化离散并接种于新的饲养层上,经反复筛选后即可获得ESCs。胚胎干细胞的培养方法ESCs的培养方法主要是有饲养层细胞培养法和无饲养层细胞培养法两种，后者又可分为LIF辅助培养法和条件培养基培养法［20］。几种方法各有利弊，使用较多的仍是有饲养层细胞培养法。采用有饲养层细胞培养法需要先准备饲养层细胞。目前使用的饲养层细胞主要有原代小鼠胚胎成纤维细胞(primarymouseembryofibroblast,PMEF)、3代〜5代小鼠胚胎成纤维细胞(mouseembryofibroblast,MEF)以及已建系的SIM小鼠成纤维细胞耐硫代鸟嘌吟和耐乌苯苷亚系(SIMmouseembryo-derivedthioguanineandouabainresistant,STO)细胞。将超排处理或未超排处理的雌鼠与雄鼠合笼，观察到有阴道栓的视为怀孕，并记为0.5d,于13d〜14d处死雌鼠取胚，把胎鼠的头、内脏和四肢去掉，剪碎消化后培养，即得PMEF。待细胞长满皿底后用丝裂酶素-C处理或X射线照射处理，使其失去增殖能力，即可作为饲养层细胞用于ESCs培养［14-15］。PMEF对ESCs的抑制分化和促生长作用优于STO,但其生命期有限，不能长期传代，而且随着传代次数的增多，其分泌各种因子的能力下降，甚至丧失；也不具有耐药性，不能用于转染外源基因的胚胎干细胞的筛选。目前已有转染新霉素抗性基因和白血病抑制因子(leukemiainhibitoryfactor，LIF)基因的STO细胞，既能保证足够量的LIF，又能用于转基因ESCs的筛选［8-9］。STO细胞是已建成的细胞系，处理相对简单。采用无饲养层细胞培养法要配制含有各种因子成分的培养基，能完全支持ESCs的生长和抑制分化［21］。培养基分LIF辅助培养基和条件培养基。LIF辅助培养基利用LIF能抑制ESCs分化的原理，通过添加LIF和其他一些促生长细胞因子维持ESCs的生长和未分化状态［10-11］。研究表明，在无饲养层培养基中添加LIF(10ng/mL)即能抑制ESCs分化、促进细胞增殖，并形成全能性ESCs。如果通过转基因技术将编码LIF的基因导入ESCs，则可能建立不需要依赖环境LIF即可维持连续传代而不分化的ESCs系。采用条件培养基培养时要先用ESCs培养基培养细胞(如大鼠心肌细胞)，一段时间后收集培养基过滤冷冻备用。常用条件培养基有大鼠心肌条件培养基、BRL(Buffaloratlivercells）条件培养基，其原理和有饲养层细胞培养法相同，利用活细胞分泌的因子促进ESCs生长和抑制其分化。完善的无饲养层细胞培养法是ESCs分离培养的一个发展趋势。胚胎干细胞的传代接种后培养2d即能看见ESCs小集落的出现，3d〜4d时逐渐增大，至6d〜8d时即可进行传代培养。传代时挑选集落较大、形态典型、细胞分化较少的用玻璃针或毛细玻璃管分离下来，于消化液中消化，分散细胞团。第一次传代时不要消化至单细胞，以免传代后难以形成集落；以后的传代过程中可以消化成单细胞，以便于分离ESCs的克隆。一旦ESCs筛选成功尽量不要改变培养条件，否则很容易引起分化［9-10,20］。胚胎干细胞的生物学特性形态学特征在体外培养中，ESCs细胞形态为圆形或扁圆形，核大、浆少、核质比高。体外培养时，细胞排列紧密，单层或多层密集堆积而形成岛状或巢状，边缘清晰，折光性强，集落边缘可见有少量的已经分化为扁平上皮细胞或梭形的成纤维细胞。用碱性磷酸酶染色法染色，ESCs呈棕红色，而围的成纤维细胞则呈淡黄色［15-16］。基本生物学特征①全能性。在体外培养的条件下，胚胎干细胞可以诱导分化为机体的任何组织细胞。②无限增殖性。胚胎干细胞在体外适宜条件下,能在未分化状态下无限增殖。③胚胎干细胞具有种系传递的功能。④胚胎干细胞易于进行基因改造操作。⑤胚胎干细胞保留了正常二倍体的性质且核型正常［14］。表达特性ESCs表达的早期胚胎阶段特异性抗原有：SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81、ECMA-7等。ESCs还表达Oct4、Fgf4、H2az、Foxd3、Nanog和Sox2等与多能性有关的关键蛋白［22-23］。另外，ESCs具有高的端粒酶活性和碱性磷酸酶活性等。胚胎干细胞的鉴定基于胚胎干细胞的生物学特性，对分离培养的细胞进行综合评定，以鉴定其是否为胚胎干细胞。形态学鉴定根据ESCs形态学特征进行鉴定。形态学检测是ESCs培养中最直观、最常用的鉴定标准，通过形态可以判断细胞的生长情况［14-19］。表面抗原检测ESCs及早期胚胎细胞表面有一些特定抗原，用相应抗体检测抗原的存在，从而鉴定是否为ESCs［22-23］。4.3碱性磷酸酶(AKP)活性的检测碱性磷酸酶在ESCs中含量较高，而在已分化的细胞中活性明显降低。用固蓝KR或固绿B盐、萘酚AS-TR染色未分化ESCs后呈深蓝紫色［15-16］。核型分析检测已建立的ESCs是否具有二倍体正常的核型。将ESCs用秋水仙素处理后胰蛋白酶消化成单细胞，再用低渗溶液处理，固定、染色，最后在油镜下观察［15-16］。体外分化试验体外分化试验将ESCs悬液培养形成囊状简单胚体或类胚体这类细胞多为自发分化，随培养条件和细胞密度而有所不同。常见多种类型的细胞混杂在一起［14,21］。体内分化试验是将ESCs悬液化注射给同种动物皮下。制作切片染色可观察到瘤块，类似畸胎瘤，除大量的干细胞巢和间质细胞外，还包括神经管、腺管、上皮组织、软骨和肌肉等多种类型的分化细胞。Oct-4活性检测Oct-4基因是小鼠胚胎发育早期、生殖细胞谱系以及体外培养的多能干细胞特异性表达的一种发育多能性的标志基因。通过鉴定Oct-4基因表达情况，来判断干细胞的多能性［8-9,23］。嵌合试验嵌合体的构建有3种方法，使用较多的是囊胚内注入法。将ESCs注入囊胚腔后培养恢复，然后移植到同期受体子宫内使胚胎继续发育，注入的ESCs参与胚胎发育过程，在新生个体的几乎所有组织（包括生殖系统）内都能检测到。通过嵌合可以证明ESCs具有全能发育的潜能［8-10］。影响胚胎干细胞分离培养的因素胚胎来源与质量胚胎质量是影响ESCs分离培养的关键因素，只有生命力旺盛的健康胚胎细胞才可能在体外培养环境下生存。目前胚胎干细胞的分离主要从囊胚的ICM和早期胚胎的生殖嵴获得。研究表明，桑椹胚或囊胚质量与胚胎形成ICM的形状密切相关，优秀胚胎形成的ICM呈团状，这种ICM细胞具有全能性，分离和克隆ESCs的成功率高；良好的胚胎形成ICM呈条状或网状，部分细胞已具有分化的趋势，分离成功率不及团状ICM高；劣等胚胎形成的ICM多呈分散状，其分离ESCs的成功率最低。另外胚胎所处时期对分离培养也有影响，一般囊胚效果要好于桑椹胚，但在不同动物上的研究结果并不一样［1-5］。培养方法培养方法也是影响ESCs分离培养的关键因素，不同的方法都有其优缺点，选用恰当的方法才能取得最好的结果，目前大多数的研究认为与饲养层细胞共培养效果优于无饲养层细胞培养法［20-21］。饲养层细胞的主要作用就是提供促进ESCs生长并抑制其分化的生长因子，培养效果较好，目前绝大多数ESCs的分离培养与建系都是采用这种方法。但这种方法存在以下缺点：饲养层细胞与干细胞长在一起，不容易获得纯的ESCs；用丝裂酶素处理后，如果清洗不彻底，残留的丝裂酶素会影响ESCs的增殖；经处理后的饲养层细胞寿命缩短，共培养过程中死亡的细胞释放出的染色体可能会引起ESCs的突变及影响正常核型的保持。为了促进ESCs的生长又维持其未分化状态，在培养体系中还可以加入一些因子，如抑制细胞分化的LIF，促生长的干细胞生长因子(stemcellfactor， SCF)、碱性成纤维生长因子(basic-fibroblastgrowthfactor，bFGF)、胰岛素样生长因子-1(insulin-likegrowthfactor-1，IGF-1)［8,20-21］。培养基成分培养基要有促进ESCs生长和抑制其分化的双重作用，目前在ESCs细胞的培养中多采用高糖DMEM加15%的FBS做基础培养基,另外添加一些细胞因子等微量成分［20-21］。饲养层细胞饲养层细胞的质量和来源影响ESCs的分离培养效果,现在使用最多的是PMEF和STO。在小鼠以外的其他动物ESCs研究中，研究者已经从同源饲养层细胞上寻找提高培养效果的方法,但使用小鼠MEF也能获得成功，相比之下并没有显出太大的优越性［4,21］。血清质量及添加量血清在ESCs培养中几乎是必需的，添加量也是很大的。由于血清直接取自动物，不同批次的血清会因个体差异而在成分上稍有不同；另外血清中蛋白、内毒素等一些不利于ESCs生长的成分含量也不一样。不同批次的血清对试验结果有重要影响，添加过高或过低的血清都不利于胚胎细胞的增殖和ESCs的分离。很多研究认为血清质量对ESCs分离培养效果影响很大，在一次ESCs培养中最好使用相同的血清。存在问题抑制分化的问题抑制分化是ESCs分离培养中的关键性因素，也是决定ESCs质量和能否建系成功的重要因素。对细胞分化机制仍不完全清楚，抑制ESCs分化显得比较困难。现在研究者主要是通过直接添加细胞因子，或者采用共培养体系由共培养细胞分泌一些细胞因子，以抑制ESCs分化［17］。这种抑制只是一定程度上的作用，培养物表面总有些细胞发生分化，培养环境的稍稍改变也会引起分化。虽然获得均一、未分化的ESCs在其研究和应用中非常重要，但是抑制ESCs分化也并非像关闭一个开关那样简单。诱导分化的问题诱导分化看似是一个与抑制分化相反的过程，但它较后者更为复杂。诱导的关键是定向分化，获得专一类型的组织细胞。在临床治疗上通过干细胞移植来修复损伤组织是干细胞应用的一个重要途径，但从近年的研究来看直接移植ESCs是不可行的，很容易形成瘤性组织。经过诱导后使ESCs朝着目标组织发生分化，形成定向的组织或细胞才能用于移植，移植物要求纯度高，分化程度一致。现在已经获得人和小鼠的较稳定ESCs系，并成功诱导获得了一些组织细胞，如神经、心肌等，但并不能控制ESCs定向均一分化［7-10］。安全性问题ESCs应用的安全性问题主要表现在两个方面，一是移植后效果不稳定，治疗重复性差，目前的研究认为ESCs移植前的培养和处理对治疗效果有重要影响［9］；二是生物安全，