体细胞杂交课件

体细胞杂交技术的应用原生质体融合杂种细胞发育动态及体细胞杂种鉴定体细胞杂交的概念第一节体细胞杂交一、体细胞杂交的概念概念：体细胞杂交，即原生质体融合，将两个不同亲本的原生质体，经人工诱导融合并培养再生成株的过程，统称为体细胞杂交（A+B）。几种不同的表述：体细胞杂交：Somatichybridization细胞融合：Cellfusion原生质体融合：Protoplastfusion无性杂交：asexualhybridization超性杂交：Parasexualhybridization超性融合：Parasexualfusion细胞操作：Cellmanipulation细胞工程（Cellengineering）体细胞杂交与有性杂交的异同比较内容体细胞杂交有性杂交时间无季节限制花期限制，特别是母本的花期亲缘关系一定程度上可以克服有性/嫁接不亲和性受亲和性影响结果细胞核、细胞质均可以重组、倍性增加双受精，一般无细胞质重组，倍性不改变PossibleResultofFusionofTwoGeneticallyDifferentProtoplasts=chloroplast=nucleusFusionheterokaryoncybridcybridhybridhybrid=mitochondria原生质体融合的有关名词-I对称杂种（双亲给杂种贡献的遗传物质均为100%）非对称杂种（双亲给杂种贡献的遗传物质不等（相对值）胞质杂种（cytoplasmichybrid,Cybrid）：细胞质重组，细胞核未重组对称融合（symmetricfusion）

也称标准融合（Standardfusion）非对称融合（asymmetric

fusion）：融合前对一方进行处理，使其染色体丢失一部分原生质体融合的有关名词-II供-受体融合：Donor-recipientfusion体配融合（gameto-somaticfusion）（性细胞与体细胞融合）亚原生质体-原生质体融合：

Subprotoplast-protoplastfusion

小原生质体：Miniprotoplast

微原生质体：Microprotoplast

胞质体：Cytoplast胞质体-原生质体融合:Cytoplast-protoplastfusion发展历程70年代，技术建立和完善优化1972年获得烟草种间体细胞杂种1975年高Ca高pH加PEG融合方法，电融合法大量成功报道，不少为异想天开的实验80年代初，由模式植物转向农作物/经济作物，对称融合到非对称融合，创造新种质的技术手段80年代末，大量木本植物细胞融合成功的报道90年代至今，成为一种育种手段理论上，任何细胞都可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。根据融合时细胞的完整程度，原生质体融合可分为两大方式：

对称融合（symmetricfusion）－即两个完整的细胞原生质体融合。非对称融合（asymmetricfusion）－利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再进行融合。

二、原生质体融合融合方法原生质体融合过程影响原生质体融合的因素融合方法PEG融合电融合Polyethyleneglycol（PEG）Electrofusion,Electricallyinducedfusion1.PEG诱导融合法

PEG诱导融合的特点：优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。缺点是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。

PEG作用机理：Kao等认为，由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在原生质体之间形成分子桥，其结果使原生质体发生粘连进而促进原生质体融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。

P1P2P1P2混合静止1min.融合融合液加入PEG稀释洗涤加入稀释液加入培养基培养选择2．电融合法

Electrofusion,Electricallyinducedfusion与PEG融合相比，电融合有三大优点：不存在对细胞的毒害问题；融合效率高；融合技术操作简便。Electrofusion:AhighfrequencyACfieldisappliedbetween2electrodesimmersedinthesuspensionofprotoplasts-thisinduceschargesontheprotoplastsandcausesthemtoarrangethemselvesinlinesbetweentheelectrodestoformpearl-chain.Theyarethensubjecttoahighvoltagedischargewhichcausestheirmembranestofusewheretheyareincontact.电融合的基本过程：

细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起并圆球化。

关于融合参数：交流电压交变电场的振幅频率交变电场的处理时间直流高频电压脉冲宽度脉冲次数

影响原生质体融合的因素

原生质体质量对细胞融合起着至关重要的作用，高质量的原生质体是细胞融合的首要条件

融合方法融合参数，包括各种融合液都应选择适当

三、杂种细胞的发育动态

及体细胞杂种鉴定杂种细胞的发育动态杂种细胞选择系统与体细胞杂种植株鉴定体细胞杂种的特点体细胞杂种后代的遗传2．体细胞杂种鉴定形态鉴定：根据双亲的形态学性状观察进行鉴定。细胞学鉴定：细胞器鉴定、染色体鉴定、染色体原位杂交生化鉴定：同功酶鉴定分子鉴定：RFLP、RAPD、SSR等分子标记形态鉴定和同功酶鉴定染色体原位杂交GISH、FISHRAPD标记鉴定510

1100670bp75025050020001000bp

1234567891011121314体细胞杂种的遗传1．细胞分裂与染色体丢失如果细胞分裂而核不发生融合，在以后的发育过程中会有两种结果：一是细胞分裂几次后即停止生长从而导致死亡；二是在发育过程中某一亲本的细胞核部分或全部丢失。

减数分裂时染色体配对异常：环形、染色体桥等。2．基因转移与性状表达由于染色体的部分丢失，常常使某个亲本的部分或个别基因与另一亲本的染色体发生整合，其结果是实现了亲本间的基因转移。基因转移通常在后代中某些性状得以表达，有时由于基因的重组也可能产生双亲均没有的新性状。

3．体细胞杂种遗传上的不稳定性

体细胞杂种后代在遗传上常常不稳定，这可能涉及到多方面的因素，如亲缘关系的远近、培养过程中的染色体变异、细胞核、细胞质遗传物质的重组等。

4．体细胞杂种的核质遗传1）核遗传：双亲之和，少数有重组和丢失2）

线粒体遗传：往往有重组，柑橘上例外，仅来自愈伤组织亲本3）叶绿体遗传：随机分离，也有共存现象四、体细胞杂交技术的应用获得新物种获得新种质和新品种转移细胞质基因控制性状体细胞杂交技术展望体细胞杂交技术的应用克服生殖障碍，创造新种质；转移有益性状，改良作物品质；转移部分染色体，创造非对称杂种；转移胞质基因组，创造胞质杂种；作为育种中间材料（bridgematerial），进一步用于作物改良。

杂种组合新属萝卜Raphanussativus（2n=18）+甘蓝Brassicaoleracea（2n=18）Raphanobrassica甘蓝Brassicaoleracea（2n=18）+Moricandiaarvensis（2n=27,28）Moricandiobrassica芝麻菜Erucasativa（2n=22）+甘蓝型油菜Brassicanapus（2n=38）Erucobrassica二行芥Diplotaxismuralis（2n=42）+甘蓝型油菜Brassicanapus（2n=38）Diplotaxobrassica烟草Nicotianatabacum（2n=24）+番茄Lycopersiconesculentum（2n=24）Nicotiopersicon马铃薯Solanumtuberosum（2n=24）+番茄Lycopersiconesculentum（2n=24）Solanopersicon曼陀罗Daturainnoxia（2n=48）+颠茄Atropabelladona（2n=24）Daturotropa水稻Oryzasativa（2n=24）+稻稗Echinochloaoryzicola（2n=24）Oryzochloa通过原生质体融合获得的属间体细胞杂种

体细胞杂种性状抗性Nicotianatabacum+N.nesophila

烟草花叶病毒（tobaccomosaicvirus，TMV）Solamuntuberosum+S.chacoense马铃薯X病毒（potatovirusX，PVX）N.tabacum+N.nesophila烟草角蠕虫（tobaccohornworm）S.tuberosum+S.brevidens马铃薯卷叶病毒（potatoleafrollvirus，PLRV），晚疫病（lateblight），马铃薯Y病毒（potatovirusY，PVY）S.circalifolium+S.tuberosum疫霉属（Phytophthora）S.melongena+S.sanitwongsei青枯假单胞菌（Pseudomonassolanacearum）S.tuberosum+S.commersonii耐霜冻（frosttolerance）Brassica.napus+B.nigra十字花科黑胫菌（Phomalingam）B.oleracea+Sinapisalba甘蓝长尾交链孢霉（Alternariabrassiceae）B.napus+Sinapisalba甘蓝长尾交链孢霉（Alternariabrassiceae）Citrussinensis+Poncirustrifoliata脚腐病（Phytophthora）Lycopersiconesculentum+L.peruvianum烟草花叶病毒（TMV），斑萎病毒（spottedwiltvirus），coldtolerance原生质体融合转移的一些遗传性状

农艺性状（通过胞质杂种转移）

N.tabacum+N.sylvestris链霉素抗性（Streptomycinresistance）

三嗪抗性（Triazineresistance）S.nigrum+S.tuberosum三嗪抗性（Triazineresistance）B.nigra+B.napus潮霉素抗性（hygromycinresistance）N.tabacum+N.sylvestris细胞质雄性不育（CMS）B.campestris+B.napus细胞质雄性不育（CMS）B.napus+B.campestris+Raphanussativa细胞质雄性不育（CMS）和三嗪抗性（Triazineresistance）L.esculentum+Solanumacaule细胞质雄性不育（CMS）B.napus+B.tournefortii细胞质雄性不育（CMS）柑橘体细胞杂交策略Strategies

forProtoplastFusioninCitrus

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